牛型布魯氏菌蘋果酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患慢性細菌性傳染病,該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行并嚴重危害著人畜健康。布魯氏菌在宿主體內(nèi)生存能力極強,在巨噬細胞內(nèi)具有極強的繁殖能力以及防止殺傷的自我保護能力,但其不具有經(jīng)典的毒力因子且不能引起強烈的先天性免疫,因而給布魯氏菌的防治帶來了很大的困難。體內(nèi)誘導(dǎo)基因涉及病原菌在體內(nèi)的生存和致病過程,本研究對本實驗室篩選、鑒定的布魯氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原-蘋果酸脫氫酶的

2、酶學(xué)特性及生物學(xué)功能開展研究,探討MDH在布魯氏菌致病過程的機制。
　　 本研究以牛型布魯氏菌A19株基因組為模板,通過PCR技術(shù)擴增出牛型布魯氏菌MDH的編碼基因Malatedehydrogenase(mdh),測序結(jié)果表明,該基因大小為936bp,與NCBI上公布的布魯氏菌2308(登錄號:NC_007618.1)序列100%同源。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后與表達載體pET-28a(+)連接,成功構(gòu)建pET-28a-MDH重組質(zhì)粒,

3、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后,成功表達大小約為36KDa的融合蛋白His-MDH。通過優(yōu)化表達條件,His-MDH主要以可溶性方式表達,利用表達載體pET-28a(+)上的6His-Tag標記,通過Ni+親和層析柱成功對His-MDH進行純化,為進一步研究該蛋白的酶學(xué)性質(zhì)及免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。
　　 蘋果酸脫氫酶(MDH)是三梭酸循環(huán)中的一個關(guān)鍵酶,MDH以NAD+為輔因子,催化蘋果酸赫與草酰乙酸鹽

4、的相互轉(zhuǎn)化。本研究對表達、純化的布魯氏菌MDH的酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究,結(jié)果表明:在體外催化蘋果酸鹽與草酰乙酸鹽的酶促反應(yīng)中,最適pH值為6.0,反應(yīng)最適溫度為42℃,在50℃以下酶的穩(wěn)定性較好,Zn2+、pb2+和Cu2+對酶有明顯的抑制作用。酶動力學(xué)參數(shù)測得Km為0.67(mM),Vmax為0.91(umolml-1min-1)。
　　 生物信息學(xué)分析表明,該酶為四聚體,單體存在N-端的NAD結(jié)合區(qū)、催化區(qū)及C-端尾區(qū)三個結(jié)

5、構(gòu)域,同時也存在與底物結(jié)合位點,疏水結(jié)構(gòu)易形成酶的口袋結(jié)構(gòu),通過對不同細菌MDH的酶學(xué)活性位點分析,對布魯氏菌MDH可能存在的酶活位點進行預(yù)測。以重組質(zhì)粒pET-28a-MDH為模板,采用重疊引物延伸PCR技術(shù)在布魯氏菌mdh基因中分別引入六個點突變(R89L、D149V、R152L、H176P、D178V、A231V)后與表達載體pET-28a(+)連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌B121(DE3)中,通過誘導(dǎo)表達與純化,成功獲得六個點突變的重組M

6、DH。通過對MDH酶學(xué)活性的比較測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除D178V點突變對酶活基本無影響外,其它五個點突變都可以使酶活完全喪失。
　　 WesternBlot檢測結(jié)果表明,重組His-MDH能與布魯氏菌陽性牛血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明MDH具有免疫原性。用His-MDH作為包被抗原,對臨床收集的30份布魯氏菌陽性牛血清進行ELISA檢測,結(jié)果所有被檢血清均為陽性反應(yīng),表明MDH可作為潛在的用于牛型布魯氏菌感染診斷的靶蛋白。生物信息學(xué)對MD

7、H的氨基酸一級序列抗原性、親水性、表面可及性以及柔韌性等指標的分析,一共預(yù)測了8條B細胞線性表位。此外,對MDH的亞定位結(jié)果表明,MDH為膜相關(guān)蛋白;纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性分析以及布魯氏菌感染的Hela細胞實驗表明:MDH蛋白具有纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性,參與布魯氏菌對宿主細胞的入侵過程。
　　 本研究通過對布魯氏菌蘋果酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)以及免疫學(xué)特性研究,對闡述MDH參與布魯氏菌致病過程中的作用提供依據(jù),為進一