可注射性同種異體工程化軟骨的構(gòu)建

1、<p>　　可注射性同種異體工程化軟骨的構(gòu)建</p><p>　　作者：羅家勝　李貴澤　崔鵬程　高鵬飛 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 軟骨 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 軟骨;軟骨細(xì)胞;生物醫(yī)學(xué)工程;生物相容性材料 </p><p>　　摘 要:目的 研究在有免疫力的動(dòng)物體內(nèi)形成同種異體工程化軟骨的可行性;并驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)

2、使用的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝膠（Copolymer gel of ethylene and propylene oxide）在組織工程研究中應(yīng)用的可行性. 方法 無菌條件下取新生兔關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化，將軟骨細(xì)胞和生物材料復(fù)合成細(xì)胞濃度為5×107 ml </p><p>　　-1 的復(fù)合物并移植于兔皮下，同時(shí)設(shè)立單獨(dú)注射細(xì)胞和材料兩個(gè)對(duì)照組.分別于4，6，8，12wk取材行大體觀察，石蠟切片

3、HE染色，Safranin O染色，Masson’s三色染色，了解軟骨形成情況. 結(jié)果 2wk后即可于皮下觸及新生結(jié)節(jié)，4wk后取材即有基質(zhì)分泌及膠原形成.于6wk左右軟骨接近成熟，生物材料基本吸收.8，12wk軟骨基本接近正常軟骨.實(shí)驗(yàn)中未見明顯的免疫排斥反應(yīng).而對(duì)照組未見軟骨形成. 結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)使用的生物材料具有良好的生物相容性，可降解性，無細(xì)胞毒，是較理想的組織工程生物材料;應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)的方法可在有免疫力的動(dòng)物體內(nèi)形成同種異體工

4、程化軟骨，這為臨床某些美容和重建手術(shù)提供了一種微創(chuàng)而可塑型的可能的手段. </p><p>　　Keywords:cartilage;chondrocytes;biomedical-engineering;biocompatible materials </p><p>　　Abstract:AIM To study the feasibility of the formation of

5、allogeneic tissue engineered cartilage in immunocompetent an-imal and to verify that the material used in our experiment　has the ideal features as tissue-engineering biomaterial.METHODS Fresh newborn rabbits’articular ca

6、rtilages were obtained under sterile condition（&lt;6h after death）and incu-bated in the sterile3g&#12539;l-1 typeⅡcollagenase solution.Af-ter digestion of8～12h，the solution was filtered through a150micron nylon m

7、esh and ce</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　在臨床工作中，治療由于軟骨缺損導(dǎo)致功能障礙或畸形的病人多用同種異體，自體或人工合成替代物治療.但由于存在免疫排斥，取材受限及感染等問題，臨床醫(yī)生正在尋找一種更為理想的治療方法.組織工程的應(yīng)用是解決上述問題的一個(gè)新途徑［1-2］ .目前軟骨的組織工程研究已取得了很大進(jìn)展［1-4］

8、.但由于形成組織工程軟骨所需的軟骨細(xì)胞數(shù)量大，取自體軟骨量小不足以形成新軟骨，量大則造成新的損傷.而軟骨細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后其分泌基質(zhì)及分裂能力將逐漸減弱［3］ .這就使得軟骨“種子”細(xì)胞的數(shù)量問題成為制約這一技術(shù)發(fā)展的一個(gè)因素.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用國內(nèi)自行合成的可注射性生物材料聚氧化乙烯丙烯凝膠與同種異體軟骨細(xì)胞混合，探討在有免疫力的動(dòng)物體內(nèi)形成新軟骨的可行性. </p><p><b>　　1 材料和方法 <

9、/b></p><p>　　1.1 材料 新西蘭大白兔12只（清潔級(jí)，體重1.5～2.0kg，第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供），新生兔（1～2d）20只，Ⅱ型膠原酶（Sigma公司），250g&#12539;L-1 聚氧化乙烯丙烯凝膠（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院陳富林博士提供），Ham-F12培養(yǎng)基（Gibco公司）. </p><p>　　1.2軟骨細(xì)胞分離 新生兔于750mL&

10、amp;#12539;L-1 酒精中浸泡處死，無菌條件下切取膝關(guān)節(jié)，盂肱關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)等處軟骨，去除表面軟組織，切成約2mm×2mm×2mm大小的碎塊，以磷酸鹽緩沖液（PBS，含青、鏈酶素各100umL </p><p>　　-1 ）沖洗二遍，加入約2倍體積3g&#12539;L-1 Ⅱ型膠原酶于37℃恒溫消化8～12h，每30min搖動(dòng)一次.以150目尼龍網(wǎng)篩過濾，離心，沉淀細(xì)胞以PB

11、S洗滌2遍.用含200mL&#12539;L-1 胎牛血清的Ham-F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查活力，活力大于85%備用. </p><p>　　1.3 軟骨細(xì)胞與生物材料復(fù)合物的制備和移植 用上面制備的軟骨細(xì)胞與聚氧化乙烯丙烯凝膠混合制備成細(xì)胞濃度為5×107 mL-1 的復(fù)合物5］ .用12號(hào)針頭將其接種到12只新西蘭大白兔背部皮下，每只2點(diǎn)，每點(diǎn)0.3mL.同時(shí)在12只

12、新西蘭大白兔背部皮下分別注射聚氧化乙烯丙烯凝膠和濃度為5×107 mL-1 的細(xì)胞懸液每只各一點(diǎn)，每點(diǎn)0.3mL，作為對(duì)照.分別于4，6，8，12wk后取材.實(shí)驗(yàn)組每次取材6點(diǎn)，對(duì)照組各取3點(diǎn).行大體觀察，常規(guī)石蠟切片HE染色，Safarinin O染色，Masson’s三色染色，了解軟骨的形成情況. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><

13、p>　　實(shí)驗(yàn)組2wk后可于皮下觸及新生軟骨結(jié)節(jié)，質(zhì)韌.4wk取材見新生結(jié)節(jié)呈白色，表面有輕度纖維包裹，質(zhì)地較2wk時(shí)硬，切片HE染色見已有部分較小的陷窩形成，但軟骨細(xì)胞形態(tài)尚不十分典型，軟骨周邊有部分淋巴細(xì)胞浸潤，聚氧化乙烯丙烯凝膠尚未完全吸收，Safranin O染色見有糖氨多糖（GAG）分泌，Masson’s三色染色見已有膠原形成.6wk以后其表面纖維包裹增厚，去除包裹后見軟骨顯磁白色，軟骨質(zhì)地接近正常軟骨，HE染色見軟骨陷窩

14、明顯，細(xì)胞形態(tài)基本正常，周邊少許淋巴細(xì)胞浸潤，聚氧化乙烯丙烯凝膠已基本吸收，Safranin O染色及 </p><p>　　Masson’s三色染色顯示GAG的分泌和膠原形成的 量均較4wk時(shí)多（Fig1，2）.8wk及12wk后淋巴細(xì)胞浸潤和纖維包裹情況比第4wk并無增多增厚，而鏡下形態(tài)更接近正常軟骨（Fig3）.對(duì)照組則無軟骨形成. </p><p>　　圖1 － 圖3 略 <

15、/p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　組織工程方法可以避免因取材而造成的組織缺損和因應(yīng)用異體組織及人工替代物而導(dǎo)致的排斥反應(yīng)及感染等并發(fā)癥，在修復(fù)重建中有廣闊的應(yīng)用前景.以前的研究多應(yīng)用無免疫力的裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并已形成了人耳等形狀的軟骨［6］ .同時(shí)在有免疫力的動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用自體軟骨細(xì)胞也已形成了工程化軟骨［5］ .但軟骨“種子”細(xì)胞的數(shù)量一

16、直是軟骨組織工程研究需要解決的問題.本實(shí)驗(yàn)證明同種異體軟骨細(xì)胞應(yīng)用組織工程的方法同樣可在有免疫力的動(dòng)物體內(nèi)形成新的軟骨而無明顯的排斥反應(yīng).這一方面可能由于軟骨細(xì)胞免疫原性較弱;同時(shí)由于生物材料包裹住了軟骨細(xì)胞，隔離了與免疫細(xì)胞的接觸，而當(dāng)生物材料降解吸收以后，重新形成的基質(zhì)又起到了免疫屏蔽作用;另一方面由于經(jīng)消化后其細(xì)胞表面抗原受到破壞，從而減弱了排斥反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)證明6wk以后軟骨基本接近成熟，與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［5］ .由于本實(shí)驗(yàn)

17、采用的是異體軟骨細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)中觀察到有較輕的排斥反應(yīng)，所形成的軟骨在體內(nèi)長期的轉(zhuǎn)歸結(jié)果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察. </p><p>　　組織工程生物材料是組織工程的一個(gè)重要內(nèi)容.目前尚無商品化的生物材料，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用的生物材料種類繁多，包括PGA，PLA，藻酸鹽，膠原，Pluronic（Co-polymer gel of ethylene and propylene oxide）等，均取得了一定的效果［2，5-

18、9］ .而以上的材料多為國外合成，價(jià)格昂貴，難于購買.Cao等［6］ 曾對(duì)PGA，藻酸鹽，Pluronic進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)Pluronic在組織相容性等方面均優(yōu)于其余二者.本實(shí)驗(yàn)采用的國內(nèi)自行合成的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝膠與Pluronic是同類聚合物，它是一種溫度敏感材料，在約0～5℃時(shí)為液態(tài)，超出此范圍則變?yōu)槟z.通過本實(shí)驗(yàn)證明其可降解，具良好的生物相容性和細(xì)胞親和性，無細(xì)胞毒，降解時(shí)間約為6wk左右.不失為一種較理想的組織工程生

19、物材料.由于其可注射性及溫度敏感性，為某些美容及重建手術(shù)提供了一種新的，可塑型而微創(chuàng)的可能手段. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Joseph P.Vacanti，beyond transplantation ［J］.Arch Surg，1988;123（5）:545-549. </p><p>

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