萊氏野村菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、夜蛾科昆蟲(chóng)包含有一些重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。重要蟲(chóng)生真菌萊氏野村菌Nomuraearileyi(Farl.) Samson是該科昆蟲(chóng)較專化的病原真菌，在田間有時(shí)能在夜蛾種群中形成流行病，對(duì)于抑制蟲(chóng)口的大發(fā)生起著重要作用。和其它昆蟲(chóng)病原真菌一樣，該菌也存在著致病時(shí)間較長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境條件要求較高等缺點(diǎn)，使其真菌殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用受到限制。利用基因工程技術(shù)提高菌株毒力，是克服這些缺點(diǎn)的重要途徑。因此通過(guò)基因改造獲得適合市場(chǎng)需要的真菌殺蟲(chóng)劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。幾

2、丁質(zhì)酶是蟲(chóng)生真菌侵染過(guò)程中產(chǎn)生的重要水解酶，可以降解昆蟲(chóng)體壁中含有幾丁質(zhì)的組分，有利于克服體壁的物理和化學(xué)屏障作用，降低昆蟲(chóng)對(duì)病原真菌的防御能力，以達(dá)到加快侵染過(guò)程和提高致病能力的目的。蝎毒素是神經(jīng)多肽毒素，對(duì)昆蟲(chóng)的毒力強(qiáng)，且具有特異性和高度選擇性，而且編碼基因較小，便于分子操作，是研究蛋白質(zhì)工程、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)和離子通道等的理想材料。本實(shí)驗(yàn)以兩個(gè)分離自夜蛾科昆蟲(chóng)的萊氏野村菌菌株Nr03和Nr09作為出發(fā)菌株，分別引入外源基因球孢白

3、僵菌幾丁質(zhì)酶基因bbchit1和北非蝎(Androctonus australis)昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素多肽基因aait，分別構(gòu)建含有不同外源基因的兩個(gè)一價(jià)轉(zhuǎn)基因工程菌株。
　　 實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含有篩選標(biāo)記和目的基因的質(zhì)粒載體pbarGPE1-aait，再以該質(zhì)粒為中間載體，擴(kuò)增出含有強(qiáng)啟動(dòng)子、終止子及aait基因的GpdA-aait-TrpC基因片段，將其插入pRNA-hygro-U6.1質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個(gè)含有篩選標(biāo)記hygro

4、基因和aait基因的新質(zhì)粒pRNA-hygro-U6.1-aait。通過(guò)對(duì)萊氏野村菌分生孢子的抑制性實(shí)驗(yàn)，篩選出兩種藥物對(duì)萊氏野村菌的最佳抑制濃度，其中潮霉素B的最佳抑制濃度為80μg/ml，苯菌靈的最佳抑制濃度為2μg/ml。采用芽生孢子遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)萊氏野村菌Nr03進(jìn)行遺傳改造，獲得了一價(jià)轉(zhuǎn)蝎毒基因工程菌株Nr03-A。采用同樣方法，利用實(shí)驗(yàn)室保存的含有白僵菌幾丁質(zhì)酶基因的載體pbenGPS3-bbchitl對(duì)Nr09菌株進(jìn)行遺傳