豬流產嗜性衣原體抗體ELISA檢測與基因免疫研究.pdf

1、流產嗜性衣原體（Chlamydophila abortus，CAB）是引起豬、牛、羊等多種動物流產、死胎、弱胎等慢性接觸性疾病的一種重要病原體，孕婦也可感染而發(fā)生流產。建立準確、快速的診斷方法和研制安全、高效的疫苗是預防和控制本病的重要措施。本研究應用PCR技術獲得CAB主要外膜蛋白（MOMP）全長基因和四種不同片段大小多型性外膜蛋白90（POMP90）的編碼基因，構建重組表達質粒，進行原核表達獲得重組蛋白，探討了其在豬CAB感染血清學

2、檢測中的應用價值，建立了豬CAB間接ELISA抗體檢測方法；并構建了momp基因真核表達質粒，及細胞因子IL-2、IFN-γ編碼基因與momp基因真核共表達質粒，比較了pcDNA3.1和PCI-neo兩種真核表達載體基因免疫效應的差異，探索了細胞因子和中藥提取成分枸杞多糖對基因免疫的佐劑效應。
　　 1．本研究根據已知基因序列設計引物，以流產嗜性衣原體CP/12株的總DNA為模板，PCR擴增了momp全長基因和四種不同片段大小的

3、pomp90基因，與pMD18-T載體連接后進行測序鑒定。將目的基因與原核表達載體pGEX-KG進行連接，構建重組表達質粒，在大腸桿菌E．coli BL21中實現(xiàn)了高效表達，表達產物經Western-blot檢測分析，結果表明具有較強的免疫原性。進而以純化后的五種重組蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法，并對臨床血清進行了檢測。結果表明，重組MOMP蛋白不適合于建立間接ELISA抗體檢測方法，而四種重組POMP蛋白建立的間

4、接ELISA抗體檢測方法均具有靈敏度高、特異性好、準確等優(yōu)點，且克服了傳統(tǒng)間接血凝試驗低靈敏度、判斷主觀性強等缺點。
　　 2．將momp基因分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1和PCI-neo，構建真核表達質粒pcDNA3.1-MOMP和PCI-MOMP，并進行了小鼠免疫試驗，比較不同真核表達載體構建基因疫苗免疫效應的差異。結果表明，PCI-MOMP可誘導更高的體液免疫效應和微弱的細胞免疫，但未觀察到更有效的免疫保護。

5、>　　 3．將獲得的豬IL-2和IFN-γ編碼基因插入真核表達質粒PCI-MOMP中構建真核共表達質粒，并通過小鼠接種試驗評價了兩種細胞因子通過真核表達質粒混合免疫和基因共表達對基因免疫的佐劑效應。結果表明，兩種細胞因子既不能增強體液免疫效應，也未觀察到增強的細胞免疫效應和有效的免疫保護。
　　 4．將中藥提取成分枸杞多糖與真核表達質粒PCI-MOMP同時對小鼠進行免疫，評價了枸杞多糖對基因免疫的佐劑效應。結果表明1，枸杞多糖