小麥組蛋白變體的克隆及小麥葉綠體蛋白組比較.pdf

1、鹽、旱等逆境脅迫是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素。研究作物耐逆機(jī)理、分離耐逆基因、培育耐逆作物新品種是應(yīng)對(duì)逆境脅迫的有效途徑。植物非生物脅迫應(yīng)答是由眾多基因組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)水平進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，系統(tǒng)改變?nèi)~綠體及其他細(xì)胞器的生理活性而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)以小麥漸滲系耐鹽抗旱品種山融3號(hào)(SR3)及其親本普通小麥濟(jì)南177(JN177)為材料，一方面分析了表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的組蛋白變體與小麥鹽脅迫應(yīng)答的關(guān)系，另一方面進(jìn)行了葉綠體蛋白質(zhì)組分析，進(jìn)

2、一步認(rèn)識(shí)SR3的耐逆能力與葉綠體的關(guān)系。
　　 一、SR3和JN177組蛋白變體基因的克隆和耐逆功能分析
　　 組蛋白是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白，是構(gòu)成核小體的主要成分。組蛋白變體是特殊狀態(tài)下染色體組裝所需的組蛋白類型，一般通過替換常規(guī)組蛋白導(dǎo)致染色體重塑進(jìn)入核小體，能在表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，一系列注釋為組蛋白變體的探針在鹽脅迫下表達(dá)發(fā)生明顯變化，而且部分探針的表達(dá)量在SR3和JN17

3、7間存在顯著差異，暗示組蛋白變體在植物耐逆應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，克隆了8個(gè)組蛋白變體基因，包括H2A變體TaH2A-1～4和TaH2A.Z-1、H3變體TaH3-1～2、H4變體TaH4-1。這些基因的cDNA和基因組序列在SR3和JN177間均分別相同，其中TaH2A-4和TaH3-2含有1個(gè)內(nèi)含子。它們的氨基酸序列含有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)和核定位信號(hào)，亞細(xì)胞定位分析顯示這些變體定位于細(xì)胞核。RT

4、-PCR分析發(fā)現(xiàn)，這些基因均具有鹽脅迫響應(yīng)表達(dá)特征，并且有些只在根中表達(dá)。
　　 為了驗(yàn)證其生物學(xué)功能，我們將五個(gè)變體基因轉(zhuǎn)化到擬南芥，其中TaH2A-2、TaH2A-3和TaH2A.Z-1能正常表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因的過表達(dá)系和野生型在整個(gè)生長(zhǎng)周期中均沒有明顯差異。在NaCl、H2O2、甘露醇和各種激素處理下，TaH2A-2和TaH2A.Z-1過表達(dá)株系與野生型的萌發(fā)率、植株葉片大小和根長(zhǎng)均沒有顯著性差異。NaCl、NAA、

5、ACC、GA3處理下，TaH2A-3過表達(dá)株系與對(duì)照的萌發(fā)率、植株葉片大小和根長(zhǎng)也沒有顯著性差異。但與野生型相比，TaH2A-3過表達(dá)株系的抗旱能力增強(qiáng)，抗氧化能力降低，甘露醇處理下側(cè)根數(shù)目減少，ABA處理下萌發(fā)延遲。這些結(jié)果顯示，不同組蛋白變體在抗逆中的作用存在顯著差異，而這種差異可能源于它們?cè)谌旧w重塑中的作用機(jī)制差異，TaH2A-2和TaH2A.Z-1需要通過核小體組裝協(xié)同作用因子才能被招募到染色體上而TaH2A-3則不需要，或者

6、TaH2A-2和TaH2A.Z-1被招募到染色體上發(fā)揮與擬南芥同源蛋白相似的功能而TaH2A-3則發(fā)揮不一樣的功能。
　　 二、SR3和JN177葉綠體蛋白質(zhì)組分析
　　 葉綠體是植物細(xì)胞中進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，是植物進(jìn)行自養(yǎng)生存的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SR3的旺盛生長(zhǎng)和抗性與葉綠體同化能力相關(guān)。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)這一關(guān)系，本試驗(yàn)開展了葉綠體蛋白組學(xué)分析。我們改進(jìn)了小麥葉綠體提取方法，獲得了純度較高的葉綠體。通過

7、雙向電泳，得到了28個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中正常條件下SR3和JN77間差異的18個(gè)（JN177中表達(dá)量高的8個(gè)，表達(dá)量低的10個(gè)），NaCl脅迫下兩者間差異的2個(gè)，正常和NaCl脅迫間差異的8個(gè)。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定了21個(gè)差異蛋白點(diǎn)，主要包括光合作用相關(guān)蛋白、光合系統(tǒng)穩(wěn)定相關(guān)蛋白及蛋白質(zhì)合成/轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。其中，卡爾文循環(huán)中關(guān)鍵酶磷酸核酮糖激酶和核酮糖二磷酸羧化酶多個(gè)亞基的含量在SR3和JN1