豬體細胞核移植重構胚構建的影響因素研究.pdf

1、基因組定點修飾的轉基因克隆豬有益于農業(yè)生產和人類疾病治療。盡管，人們通過體細胞核移植技術已經得到了克隆豬和轉基因克隆豬，并從中摸索出了一些提高體細胞克隆效率的新方法；然而，由于胚胎體外發(fā)育環(huán)境的缺陷，體細胞克隆的總體效率仍然較低。本研究旨在建立一套高效的體細胞克隆豬的生產體系。研究了激素、豬卵泡液及表皮生長因子對豬卵母細胞體外成熟的影響。系統(tǒng)地探討了供核細胞、非洲綠猴腎細胞共培養(yǎng)體系及培養(yǎng)基中能量底物變化對豬核移植胚發(fā)育的影響。同時，本

2、研究探討了曲古抑菌素A（組蛋白去乙酰化抑制劑）對轉基因細胞中EGFP的表達及轉基因核移植胚發(fā)育的影響，為轉基因豬的生產奠定基礎。
　　 激素、豬卵泡液、表皮生長因子對豬卵母細胞成熟有促進作用。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中，添加10 IU/ml PMSG，10 IU/mlhCG至培養(yǎng)液中，培養(yǎng)22h后撤除激素，卵母細胞的成熟率顯著高于其他處理（P<0.05）。當培養(yǎng)液中添加10％的豬卵泡液時，卵母細胞的成熟率顯著高于其他處理（P<0

3、.05）。當培養(yǎng)液中添加表皮生長因子時，10ng/ml處理組的卵母細胞成熟率顯著高于0 ng，ml和5ng/ml處理組；然而，10ng/ml處理組和15ng/ml處理組的卵母細胞成熟率無顯著差異（P>0.05）。
　　 由于大白豬胎兒成纖維細胞易分離、生長快、傳代能力強，所以選用該細胞作為核供體細胞。對不同傳代次數的細胞進行染色體分析。結果表明，傳代7次細胞的正常核型比例在80％左右，滿足核移植的要求。隨著供核細胞傳代次數的增加

4、，重構胚的囊胚率下降。用表面光滑細胞及表面粗糙細胞分別作為核移植供體，表面光滑的細胞可以提高供核細胞與受體卵母細胞的融合率。
　　 Yasumura等人從成年非洲綠猴的腎臟分離得到Vero細胞系。盡管大量的文獻都表明Vero細胞對哺乳動物的胚胎發(fā)育有促進作用，然而，Vero細胞對豬胚胎發(fā)育的影響尚未見報道。本文首次使用Vero細胞作為滋養(yǎng)細胞，旨在探討共培養(yǎng)體系中Vero細胞對豬孤雌胚及核移植胚發(fā)育的影響。結果顯示，Vero細胞

5、共培養(yǎng)組的孤雌胚囊胚率及核移植胚囊胚率顯著高于對照組（P<0.05），即Vero細胞共培養(yǎng)體系對豬孤雌胚及核移植胚的發(fā)育都具有促進作用。
　　 將NCSU-23培養(yǎng)基中的5.56 mmol/L葡萄糖替換為0.2 mmol/L丙酮酸、5.7 mmol/L乳酸，并將此培養(yǎng)基命名為mNCSU-23。根據實驗設計，孤雌胚及核移植胚轉移到mNCSU-23或NCSU-23中培養(yǎng)。激活第2天統(tǒng)計孤雌胚及核移植胚中的5～8細胞胚胎數。激活第6天

6、統(tǒng)計孤雌胚及核移植胚囊胚形成率及囊胚細胞數。實驗結果表明，mNCSU/NCSU處理組的囊胚率顯著高丁二對照組（P<0.05）；單純使用mNCSU-23培養(yǎng)豬胚胎時，囊胚率最低，發(fā)育結果最差（P<0.05）。結果證實，在體外培養(yǎng)前兩天，用乳酸和丙酮酸代替培養(yǎng)基中的葡萄糖對豬胚胎發(fā)育有利。
　　 目前，外源基因導入真核細胞的方法主要包括：病毒感染法、原核注射法、DEAE-葡聚糖轉染法、電穿孔法、脂質體轉染法等。脂質體法操作簡單，不需

7、要昂貴的儀器設備，可大批量轉染，且對細胞毒性作用小。故本實驗采用脂質體法將pEGFP-C1載體導入大白豬胎兒成纖維細胞中，并對轉染參數進行了優(yōu)化：脂質體4μl，質粒DNA2μg，穩(wěn)定轉染6小時效率較高。將pEGFP-C1質粒載體轉染入大白豬胎兒成纖維細胞。經G418篩選后，得到穩(wěn)定轉染的陽性細胞。隨傳代次數增加，EGFP陽性細胞的比例下降。用曲古抑菌素A預處理轉基因供核細胞，同時設立對照組（供核細胞不使用曲古抑菌素A預處理）。藍光照射轉

8、基因供核細胞和轉基因的重構胚，觀察供核細胞和轉基因重構胚中EGFP的表達情況。結果表明，當用50nM曲古抑菌素A處理供核細胞時，供核細胞的EGFP陽性率顯著高于對照組；當用50nM曲古抑菌素A處理供核細胞時，重構胚中EGFP的陽性胚率顯著高于對照組（重構胚融合激活48h后），且這種EGFP表達的增加至少維持到桑椹胚階段。此外，TSA處理對轉基因細胞有毒性影響，且這種毒性影響是劑量依賴的；當曲古抑菌素A濃度高于50nM時，大部分細胞死亡。