家蠶BmAWD基因的表達、純化和亞細胞定位.pdf

1、在對本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹期cDNA文庫測序中，我們篩選到一條編碼AWD(abnorma.win.disc)蛋白的cDNA序列，將其命名為BmAWD基因。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列全長為68.bp，ORF框為46.bp，編碼154個氨基酸殘基，含有一個NDPK保守結(jié)構(gòu)域。通過PCR擴增獲得該基因ORF框并克隆到表達載體pGEX-5X-1上，得到重組表達質(zhì)粒pGEX-5X-1-AWD，將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)PCR、酶切鑒

2、定證明重組正確。在37℃下以IPTG誘導(dǎo)表達后收集菌體并裂解，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在4.kD左右處有一特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符，但目的蛋白主要以沉淀即包涵體形式存在，25℃下誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用親和層析法純化融合蛋白GST-AWD，并免疫新西蘭大白兔，制備GST-AWD多克隆抗體，ELISA檢測該多克隆抗體的效價可達到1:16000，Wester.blot檢測顯示該抗體對GST-AWD

3、有特異性識別能力。亞細胞定位表明蛋白BmAWD同時存在于Bm5細胞的細胞質(zhì)及細胞核中。提取五齡蠶的各個組織和各個時期(卵，幼蟲，蛹，蛾)的總RNA，進一步用熒光相對定量PCR檢測表明BmAWD在表皮中表達量最高，脂肪體中表達量最低，在蛹期中表達量最高，在卵期表達量最低。
　　 AWD基因為昆蟲翅盤異常發(fā)育基因，它編碼一個具有NDP激酶活性的蛋白亞基，NDP激酶除了催化核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)之間高能磷酸基團的轉(zhuǎn)