鈣對花生生長發(fā)育及其幼胚基因表達的影響.pdf

1、花生是世界四大油料作物之一，中國是世界上花生生產(chǎn)和消費最多的國家。花生功能基因研究，種子是關(guān)鍵對象：花生胚胎早期發(fā)育是花生產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要時期。南方沙質(zhì)旱地土壤地區(qū)花生常因缺鈣而嚴(yán)重空莢或不飽滿，導(dǎo)致花生減產(chǎn)降質(zhì)。為揭示花生胚發(fā)育的功能基因組，同時揭示缺鈣使花生胚敗育的分子機理，本研究在平潭縣典型缺鈣地，設(shè)足鈣與缺鈣處理使花生幼胚向可育與敗育方向發(fā)展，在對缺、足鈣條件下花生形態(tài)及相關(guān)生物學(xué)性狀差異觀察的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了缺、足鈣條件

2、下花生早期胚正反向抑制消減雜交文庫和混合全長cDNA文庫。對全長cDNA文庫進行了初步EST測序與基因注釋和功能分類，并對缺鈣花生早期胚SSH文庫進行了初步篩選，對篩選的差異基因進行了半定量RT-PCR初步鑒定。主要研究結(jié)果如下。 (1)于結(jié)莢期對缺、足鈣條件下花生幼胚發(fā)育進行了剝胚觀察，于收獲期對缺、足鈣條件下花生植株進行形態(tài)觀察，并對相關(guān)生物學(xué)性狀進行了考查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺鈣條件下花生生長后期植株比足鈣條件下更加旺盛，莖部呈現(xiàn)

3、暗紫色，多數(shù)表現(xiàn)為空莢或者爛果；足鈣花生因后期營養(yǎng)較多分配到莢果，表現(xiàn)地上部生長較差，但莢果飽滿，飽果數(shù)多。對花生早期胚敗育的分子機理與防治對策進行了探討，為指導(dǎo)生產(chǎn)實踐提供參考。 (2)利用抑制消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了缺、足鈣條件下花生早期胚正反向抑制消減雜交文庫，缺、足鈣初級文庫分別包含有1.2×106和1.4×106個克隆。所長出的菌落中分別有93.2％和91.2％為白色克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)其中單一擴增條帶的克隆分別

4、約占85.3％和86.9％，片段大小集中分布在200～800bp之間。 (3)利用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了缺、足鈣花生早期胚混合全長cDNA文庫。初級文庫的滴度為1.867×106cfu/ml，重組率為95.8％，插入片段分布于500bp-2000bp之間，擴增文庫的滴度約為9.68×1011 cfu/ml。從文庫中隨機挑選20個單克隆，進行兩端測序，結(jié)果表明全長率為45％，文庫質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求。從文庫中隨機挑取298個單克隆進

5、行5’端測序，共得到288條EST序列，平均片段大小為671bp，其中有46條EST在NCBI上沒有找到同源序列，242條EST中，主要與大豆、截型苜蓿、花生、百脈根、擬南芥等植物同源，僅有21.9％的EST序列與NCBI非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫中的已知功能基因有較高的同源性，未知功能的EST占78.1％，在已知功能的53條EST中，主要涉及蛋白質(zhì)合成加工及儲藏基因、代謝相關(guān)基因、抗病與防御相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子、細胞生長/分化相關(guān)基因、細胞結(jié)構(gòu)

6、相關(guān)基因等。 (4)利用菌落雜交的方法，分別以地高辛標(biāo)記的缺、足鈣花生早期胚cDNA為探針，與缺鈣花生早期胚抑制消減雜交文庫進行菌落雜交，初步篩選到14個差異表達基因，并對SSHQ-1，SSHQ-12，SSHQ-13，SSHQ-14進行了初步RT-PCR鑒定。結(jié)果表明，基因SSHQ-1和SSHQ-12都在缺鈣花生早期胚中表達，而在足鈣花生早期胚中沒有表達，SSHQ-13在缺鈣花生早期胚中的表達量明顯高于在足鈣花生早期胚中的表達量