柑桔碎葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)及八種柑桔類植物對(duì)其變異影響的研究.pdf

1、柑桔碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)引起的柑桔碎葉病是一種重要的柑桔病害，該病最早于1962年在隱癥的北京檸檬上被發(fā)現(xiàn)。CTLV屬于發(fā)形病毒屬(Capillovirus)，基因組為正義單鏈RNA。該病毒可由嫁接和機(jī)械感染傳播，主要為害用枳及其雜種作砧木的柑桔樹引起嫁接口不親和、植株矮化和葉片黃化。CTLV在我國分布廣泛，在浙江、湖南、福建和廣西等省的局部地區(qū)已造成比較嚴(yán)重的為害。傳統(tǒng)指示植物檢測(cè)方法

2、是鑒定CTLV的重要手段，但其存在鑒定周期長，季節(jié)性強(qiáng)，需溫網(wǎng)室設(shè)施等缺點(diǎn)。因此有必要建立快速、穩(wěn)定的檢測(cè)技術(shù)，并研究寄主對(duì)CTLV遺傳多態(tài)性的影響，為科學(xué)防控該病提供技術(shù)保障和理論依據(jù)。 本研究通過多對(duì)引物的比較，建立了CTLV的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription—polymerase chain reaction，RT—PCR)檢測(cè)體系和CTLV的實(shí)時(shí)熒光RT—PCR檢測(cè)體系。通過限制性片段長

3、度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single—strand conformation polymorphism，SSCP)技術(shù)以及序列分析對(duì)分別接種于8種柑桔類植物上的CTLB分離株HH和XLB所獲得的16個(gè)亞分離株和2個(gè)毒源的外殼蛋白基因(CP)的多態(tài)性和序列變異進(jìn)行了分析。主要結(jié)論如下： 1．應(yīng)用引物CTL5607和ASCT-3’，建立了

4、CTLB的常規(guī)RT—PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增的目的條帶大小為889bp。 2．國內(nèi)首次建立了使用SYBR GreenⅠ染料法檢測(cè)CTLV的實(shí)時(shí)熒光RT—PCR體系，該檢測(cè)體系的特異性強(qiáng)(對(duì)衰退病毒、溫州蜜柑萎縮病毒和鱗皮病毒無特異性擴(kuò)增)，靈敏度高(比常規(guī)RT—PCR靈敏100倍)，適用性廣(可檢測(cè)出多種柑桔類植物中的CTLV)，并具有污染幾率小、快速、操作和試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單等優(yōu)點(diǎn)。 3．混合侵染的CTLV分離株HH接種于8種寄

5、主后，其CP/HinfⅠ酶切圖譜沒有發(fā)生的變化；但是其CP/SSCP譜帶發(fā)生了變化，接種到錦橙、紅桔和代代酸橙中的亞分離株其CP/SSCP譜帶與毒源HH的一致都為3條，而接種到檸檬和臘斯克枳橙中的亞分離株其CP/SSCP譜帶為2條，接種到椪柑、山小桔和香橙中的亞分離株其CP/SSCP譜帶為4條。對(duì)HH和其8個(gè)亞分離株CP的序列分析發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性高達(dá)99.3％-100％。 4．株系構(gòu)成單一的CTLV分離株XLB接種于8種寄主后