生長(zhǎng)抑素DNA疫苗免疫小鼠的基因表達(dá)與免疫應(yīng)答規(guī)律研究.pdf

1、生長(zhǎng)抑素是由下丘腦分泌的一種神經(jīng)多肽，能抑制GH釋放進(jìn)而抑制動(dòng)物生長(zhǎng)。目前本實(shí)驗(yàn)室已完成生長(zhǎng)抑素DNA疫苗的構(gòu)建工作并用于臨床試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用器官成像、冰凍切片、免疫組化等檢測(cè)手段研究以減毒沙門(mén)氏菌為載體的無(wú)抗性生長(zhǎng)抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫后小鼠的基因表達(dá)與免疫應(yīng)答規(guī)律，旨在探索生長(zhǎng)抑素基因疫苗對(duì)小鼠的免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間、免疫應(yīng)答產(chǎn)生部位等，為后續(xù)的臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及將來(lái)的生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、　　 整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為以下3個(gè)部分：
　　 1.抗生長(zhǎng)抑素抗體檢測(cè)。
　　 取54只3周齡Balb/C小鼠及90只7周齡昆明小鼠，各分為S、C和P組，實(shí)驗(yàn)S組免疫非抗性pGS/2SS-M4GFP-asd疫苗，陰性對(duì)照C組免疫C500空菌，空白對(duì)照P組免疫PBS溶液。分別檢測(cè)免疫后不同時(shí)間段的血漿生長(zhǎng)抑素抗體水平，結(jié)果顯示：Balb/C小鼠免疫后13d；昆明小鼠免疫后9d，實(shí)驗(yàn)組抗體水平顯著上升。提示小鼠免疫生長(zhǎng)抑素基因疫苗

3、后，能夠產(chǎn)生針對(duì)于生長(zhǎng)抑素的特異性抗體，表明有望通過(guò)免疫中和途徑降低血漿中生長(zhǎng)抑素濃度，從而可以起到促生長(zhǎng)的作用。
　　 2.器官表達(dá)。
　　 通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察融合目的基因M4GFP轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞成功后，將帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（M4GFP）報(bào)告基因的生長(zhǎng)抑素基因疫苗C500（pGS/2SS-M4GFP-asd）免疫小鼠，12小時(shí)后開(kāi)始宰殺試驗(yàn)組和對(duì)照組取器官進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組肝臟組織、脾臟組織、腎臟組織、

4、肌肉組織在免疫后48h與對(duì)照組相比較出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明目的蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)，且用綠色熒光蛋白標(biāo)記生長(zhǎng)抑素基因疫苗進(jìn)行實(shí)時(shí)觀(guān)察是可行的。
　　 3.組織表達(dá)。
　　 免疫后宰殺試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠取肝臟、肌肉和脾臟等組織器官制備冰凍切片，用熒光顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白基因在組織器官中的表達(dá)情況。在熒光顯微鏡下可以觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組肌肉、心臟、肝臟等組織中均出現(xiàn)綠色熒光，提示采用綠色熒光蛋白標(biāo)記法檢測(cè)目的基因在小鼠

5、體內(nèi)的表達(dá)，會(huì)受到體內(nèi)自發(fā)熒光的影響，造成假陽(yáng)性綠色熒光的出現(xiàn)。
　　 應(yīng)用免疫組化方法，肌肉注射攜帶生長(zhǎng)抑素質(zhì)粒的減毒沙門(mén)氏菌后，小鼠肝臟組織、腿部肌纖維組織、脾臟組織在免疫后5d的組織化學(xué)切片中可見(jiàn)有特異性棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物出現(xiàn)，說(shuō)明減毒沙門(mén)氏菌作為載體能夠?qū)⒅亟M真核表達(dá)質(zhì)粒帶入小鼠內(nèi)臟器官中，同時(shí)外源基因（SS）得到表達(dá)。
　　 本研究成功轉(zhuǎn)化了生長(zhǎng)抑素基因的真核表達(dá)載體，并證實(shí)以減毒沙門(mén)氏菌為載體的生長(zhǎng)抑素基因疫苗免