紫花苜蓿根際氫氧化細菌的分離鑒定及促生機制研究.pdf

1、為進一步篩選對植物生長具有明顯促進作用的氫氧化細菌，逐步開發(fā)微生物肥料以促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以陜西地區(qū)不含吸氫酶的結(jié)瘤豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa)根際為研究材料，逐步完善氫氧化細菌的分離、培養(yǎng)技術(shù)；深入了解其生理生化特性，并進行鑒定，豐富現(xiàn)有的基于氫氧化細菌的種屬分類地位的研究；探索其促進植物生長的作用機制，主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 利用持續(xù)通H2的氣體循環(huán)培養(yǎng)體系，以電解水的方式產(chǎn)生H2，與通入的空氣

2、混合，形成流速為280 mL/min，含H2量為4.16×10-4-2.42×10-3 mol/L的混合氣體，富集土壤中的氫氧化細菌，富集的土壤樣品經(jīng)礦質(zhì)鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，共分離純化出37株細菌。 氣相色譜測定菌株的氧化H2能力，結(jié)果顯示有8株菌的吸氫值大于2.44×10-4 mol/L，占測定菌株總數(shù)的25.93％，初步確定為氫氧化細菌。其中菌株WMQ-7和FMG-5的吸氫值大于12.28×10-4mol/L，而菌株WMQ-7

3、的氧化氫能力最強，達19.90×10-4mol/L。 通過對8株氫氧化細菌的形態(tài)觀察和生理生化實驗，初步鑒定其分屬于鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、脂肪桿菌屬(Pimelobacte)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、勒米諾氏菌屬(Leminorella)、地桿菌屬(Terrabacter)和稀有桿菌屬(Rarobacter)。同時檢測了菌株WMQ-7的最適培養(yǎng)條件：最適碳源葡

4、萄糖、最適溫度30℃、最適pH7.0。 對8株氫氧化細菌進行了小麥促生實驗，平板檢測結(jié)果顯示：菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5對小麥的促生作用表現(xiàn)極為顯著，根長與空白對照相比分別增加了73.92％、74.78％、58.26％；苗長比空白對照增加34.64％以上，其中菌株FMG-3處理的小麥苗增加了67.64％；小麥種子的根上部分干重平均值比空白對照分別增加95.24％、57.14％、47.62％。菌株FMG-5、WMQ-7

5、、FMG-3處理的盆栽小麥在成熟后小麥麥粒數(shù)分別比對照多1倍以上。菌株WMQ-7、FMG-5、FMG-3處理的小麥，結(jié)穗收獲后制粉，面粉中的還原糖、總糖含量、蛋白質(zhì)含量都比對照有不同程度的提高，其中菌株FMG-3處理的小麥還原糖含量比對照提高了23.76％，總糖含量比對照提高7.38％。而菌株FMG-5對小麥蛋白質(zhì)含量的影響最為顯著，蛋白質(zhì)含量比對照提高了22.86％。 從ACC脫氨酶和鐵載體兩個方面探索氫氧化細菌促進小麥生長的

6、作用機制。利用薄層層析法篩選出一株ACC脫氨酶陽性菌株WMQ-7，茚三酮比色法檢測該菌株ACC脫氨酶活力為0.671 U/μg。 利用MSA—CAS和MKB—CAS檢測平板，通過培養(yǎng)基顏色的變化篩選產(chǎn)鐵載體的陽性菌株。菌株WMQ-7在MSA—CAS檢測平板上，菌落周圍藍色培養(yǎng)基變成粉色，而在MKB—CAS檢測平板上，菌落周圍藍色培養(yǎng)基變成黃色，說明該菌株能夠分泌產(chǎn)生鐵載體。利用紫外分光光度計檢測鐵載體，結(jié)果顯示菌株WMQ-7分泌

7、的鐵載體在404 nm處有明顯的吸收峰，吸光值為0.834。與標準品2，3—DHBA的波長掃描圖對照顯示，菌株WMQ-7分泌的鐵載體類型不是兒茶酚型。通過鄰菲噦啉檢測法，間接推算出菌株WMQ-7分泌產(chǎn)生的鐵載體的量為7.1996μg/mL。 對菌株WMQ-7、FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，氫氧化細菌在親緣關(guān)系上存在較大差異，遺傳距離較遠。其中，菌株WIVIQ-7的16S rDNA

8、序列長度為1451 bp，GC含量為，53.8％，與惡臭假單胞菌的同源性為99％，結(jié)合菌體形態(tài)和生理生化特性，進一步鑒定菌株WMQ-7為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(GenBank登錄號為EU1807744)。菌株FMG-3、FMG-5的16S rDNA序列長度分別為1034 bp、1394 bp；GC含量分別為51.7％、54.45％。菌株FMG-5與根瘤菌相似性在94％，而菌株FMG-3的16S rDNA序列在