家蠶TGF-β家族成員dpp和daw基因的功能研究.pdf

1、轉化生長因子β（TGF-β）信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑，生物進化的過程中十分保守。在人、小鼠、果蠅等研究中表明TGF-β蛋白是一種多功能的細胞間信號蛋白，在細胞增殖、識別、凋亡、專一性分化及細胞外基質合成等方面發(fā)揮重要作用，具有多種生物學效應。雖然在果蠅和哺乳動物中TGF-β信號通路研究的比較深入，但是，家蠶作為鱗翅目中一種典型的模式經濟昆蟲，關于TGF-β信號通路的研究還未見報道。本研究在成功克隆家蠶TGF-β信號通路上兩個關

2、鍵基因Bmdpp和Bmdaw的基礎上，分析了Bmdpp和Bmdaw基因的表達模式及其蛋白在家蠶BmN細胞中的亞細胞定位；研究了不同病原微生物感染家蠶后對Bmdpp和Bmdaw mRNA表達水平的影響；在細胞水平探討了調節(jié)Bmdpp和Bmdaw表達水平對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）和質型多角體病毒（BmCPV）增殖的影響；探究了TGF-β信號通路與Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi通路的相關性；通過Co-IP篩選了BmN細胞

3、中可能與Bmdpp和Bmdaw互作蛋白，并利用質譜技術對蛋白條帶進行了鑒定。期望通過探討家蠶TGF-β信號通路中Bmdpp和Bmdaw基因的功能，明確TGF-β信號通路在家蠶先天免疫途徑中的作用，其研究結果可為家蠶抗病性研究提供新的思路。本研究取得的主要結果如下：
　　1.家蠶TGF-β信號通路Bmdpp和Bmdaw基因的克隆及序列分析
　　為了研究家蠶 TGF-β信號通路的功能，我們參考果蠅的dpp（序列號：NM_0579

4、63.5）和 daw（序列號：NM_001273038.1）序列，在家蠶數據庫(http://www.silkdb.org/silkdb/)中比對獲得了家蠶Bmdpp和Bmdaw基因序列。根據現有的EST序列設計了基因特異性引物進行RT-PCR克隆，測序結果顯示，Bmdpp的ORF為1110 bp，編碼370aa；Bmdaw的ORF為1086 bp，編碼362aa。蛋白質二級結構分析顯示，Bmdpp蛋白的二級結構主要為無規(guī)卷曲和α螺旋；

5、Bmdaw蛋白的二級結構主要為無規(guī)卷曲。Bmdpp和Bmdaw均含有TGF-β蛋白結構域，推測其具有TGF-β蛋白活性，且與果蠅dpp和daw同源性較高。
　　2.家蠶Bmdpp和Bmdaw基因表達譜分析
　　為了探討家蠶 Bmdpp和 Bmdaw基因的表達規(guī)律，通過實時定量 PCR（Real-Time PCR）分析了Bmdpp和Bmdaw基因在家蠶五齡第3天不同組織(精巢、卵巢、脂肪體、頭、絲腺、馬氏管、血細胞、中腸和氣管

6、叢)的表達水平。結果顯示，Bmdpp和Bmdaw基因在血細胞中表達量最高，其它組織中表達量均較低。
　　3.家蠶Bmdpp和Bmdaw蛋白多克隆抗體制備和亞細胞定位分析
　　為了分析Bmdpp和Bmdaw細胞定位特征，將Bmdpp和Bmdaw基因分別克隆進原核表達載體pET-28a(+)，在E.coli中誘導表達，并利用重組蛋白免疫小鼠，制備了抗Bmdpp和Bmdaw的多克隆抗體。Western blotting實驗證實制備

7、多克隆抗體具特異性。細胞定位結果顯示，Bmdpp和Bmdaw主要定位在BmN細胞的細胞質膜中。
　　4. Bmdpp和Bmdaw基因對病原微生物的感染應答
　　為了探討B(tài)mdpp和Bmdaw基因對細菌和病毒感染的免疫應答，分別利用核型多角體病毒（BmNPV）、質型多角體病毒(BmCPV)和滅活的黑胸敗血芽孢桿菌（Bab）感染家蠶BmN細胞和4齡家蠶（大造）；用脂多糖（LPS）刺激家蠶BmN細胞，用滅活的大腸桿菌（E.coli

8、）感染4齡家蠶（大造），按不同時間點分別收集對照組、誘導組的細胞和家蠶組織，提取總RNA，real-time PCR檢測結果發(fā)現，在家蠶BmN細胞中，LPS、Bab和BmCPV刺激均可下調Bmdpp基因的表達，提升Bmdaw基因的表達水平；而BmNPV刺激會上調Bmdpp基因的表達水平，下調Bmdaw基因的表達。家蠶（大造）幼蟲感染BmNPV48和72 h后，血液中Bmdpp轉錄水平分別是對照組的4.4和45.9倍，Bmdaw的表達水平

9、是對照組的0.5和0.02倍；家蠶幼蟲感染BmCPV48后，中腸中的Bmdpp轉錄水平迅速提高至對照組的34倍，72后下降到與對照組幾乎一致，而Bmdaw基因的表達水平與對照組無顯著變化。
　　5.調節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達對BmNPV和BmCPV增殖的影響
　　為進一步鑒定Bmdpp和Bmdaw基因的功能，根據基因的序列分別設計、合成了3條siRNA，轉染家蠶培養(yǎng)細胞沉默Bmdpp和Bmdaw基因。分別將Bmdpp

10、和Bmdaw基因克隆進載體 pIZT/V5-His，轉染家蠶 BmN細胞系，分別篩選過表達Bmdpp和Bmdaw基因轉化細胞。然后，探討調節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達水平對 BmNPV、BmCPV增殖復制的影響。感染48 h后的real-time的檢測結果顯示，在過表達Bmdpp基因的轉化細胞中，BmNPV和BmCPV的增殖水平有不同程度地下降；在過表達Bmdaw基因的轉化細胞中，BmNPV的增殖水平明顯下降，BmCPV的增殖水平卻

11、沒有明顯變化。而沉默 Bmdpp和 Bmdaw基因，可不同程度地提升BmNPV、BmCPV的增殖水平。由此推測Bmdpp和Bmdaw基因的表達可影響病毒在細胞內增殖復制。
　　6. TGF-β信號通路與家蠶其它信號通路相關性分析
　　昆蟲體內主要存在Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi4種病原體信號識別條免疫信號通路，為了探討TGF-β通路對免疫通路可能的調節(jié)作用，我們分別選取了這4種通路的關鍵基因（spz、PGRP

12、-LB、PGRP-LE、stat、SOCS2、SOCS6、ago2、drc2），利用real-time PCR技術，檢測在了過表達Bmdpp和Bmdaw基因對免疫通路關鍵基因表達水平的影響。結果顯示，過表達 Bmdpp基因，BmSOCS2、BmPGRP-LB的表達水平分別上調了14和13倍，Bmdcr2基因的表達水平也有較明顯上調。當過表達 Bmdaw基因時，BmSOCS2基因的表達明水平與對照組相比下降了97，BmSTAT基因的表達明

13、顯也被抑制。
　　7. Bmdpp和Bmdaw基因相互作用蛋白的篩選與鑒定
　　為了研究Bmdpp和Bmdaw與家蠶BmN細胞的相互作用蛋白，采用免疫共沉淀技術從過表達 Bmdpp和 Bmdaw的家蠶 BmN細胞中篩選互作蛋白，然后對與Bmdpp和Bmdaw互作的候選蛋白進行質譜鑒定，共鑒定了10種蛋白。信息分析結果顯示，這些蛋白涉及到信號傳導、細胞增殖分化、離子通道、卵巢發(fā)育、核苷酸降解、免疫應答、細胞周期與凋亡等各個方面

14、。
　　綜上所述，本研究克隆了家蠶TGF-β信號通路中兩個基因Bmdpp和Bmdaw，分析了Bmdpp和Bmdaw基因的主要序列特征和表達模式；明確了Bmdpp和Bmdaw基因對家蠶病原微生物誘導的應答反應；發(fā)現調節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因的表達水平可顯著性地影響B(tài)mNPV和BmCPV在細胞中的增殖；免疫共沉淀結果鑒定了在家蠶BmN細胞中可能與Bmdpp和Bmdaw基因相互作用的蛋白，研究結果不僅加深了我們對家蠶TGF-β信號通