CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導羊MSTN基因敲除和定點整合fat-1基因的研究.pdf

1、提高家畜產(chǎn)肉性能，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的肉用家畜新品種是育種工作的目標之一，通過基因編輯技術可以快速改變特定基因組成，獲得需要的優(yōu)良性狀。MSTN基因為骨骼肌生長的負調(diào)控因子，該基因的突變會導致動物肌肉發(fā)達、體重增加;fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶，可以將多不飽和脂肪酸從ω-6轉化為ω-3形式，fat-1基因的增加有利于提高動物體內(nèi)ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了敲除山羊MSTN基因的同時在該

2、位點插入fat-1基因的gRNA載體和fat-1基因定點敲入載體，利用電轉法將載體轉入絨山羊胎兒成纖維細胞中，篩選陽性單克隆細胞，通過體細胞克隆的方法生產(chǎn)轉基因絨山羊，期望培育出在提高羊肉產(chǎn)量的同時增加羊肉中ω-3含量的家畜新品種。
　　1、載體的構建
　　本實驗成功構建了2對基于MSTN基因一號外顯子的gRNA表達載體，通過Survery酶切突變檢測gRNA2突變效率高于gRNA1;同時成功構建了含有fat-1外源基因且可

3、以定點整合至宿主基因組MSTN位點的敲入載體5'h-pCAGDNA3-fat-1-3'h。
　　2、轉基因單克隆細胞系的篩選
　　本實驗使用電轉法將線性化的fat-1載體、gRNA2和Cas9載體按比例轉入羊胎兒成纖維細胞中，通過流式細胞儀和口吸管2種方法挑取單克隆細胞。共成功獲得156株單克隆細胞，經(jīng)過PCR和測序鑒定，其中在MSTN基因位點定點整合fat-1基因的細胞系40株，外源基因整合效率為25.64％。