轉基因煙草中啟動子活性對RNA介導的病毒抗性的影響.pdf

1、RNA干擾（RNA interference，RNAi）是外源或內源性的雙鏈RNA誘發(fā)地特異性降解與之同源的mRNA，從而導致相應基因不表達的現象。目前已經發(fā)現存在于動物、植物及真菌等生物體中，是生物細胞抵御外來遺傳因子入侵以保持自身基因組完整性的防御機制。對于它的機制，人們從轉基因結構及轉錄速率等不同角度研究影響RNA沉默的因素。啟動子是一段提供RNA聚合酶識別和結合的DNA序列，是基因表達調控的一種重要的順式元件。為了檢測不同啟動子

2、對RNA介導病毒抗性的影響，本研究選擇了裂葉矮牽牛堿性亮氨酸拉鏈的蛋白質（PNZIP）基因啟動子、花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子和玉米泛素蛋白（polyubiquitin）基因Ubi啟動子三種啟動子進行研究，結果對于將來有效地選擇啟動子成功應用RNA介導的病毒抗性策略提供依據，具有重大指導意義。具體結果如下：
　　 1、PVYCP基因3’端的400bp和500bp為目的片段，分別插入到雙元表達載體pCAMBIA1300

3、中，構建莖長度為400bp，環(huán)長度100bp的發(fā)夾結構植物表達載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR.
　　 2、將所構建的植物表達載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR及空pCAMBIA1300利用凍融法導入農桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質粒均已成功正確導入農桿菌中。
　　 3、葉盤法轉化煙草NC89。經卡那霉素對再生植株進行抗性篩選，后經PCR檢測，分別獲得轉pCAMB

4、IA1300的煙草30株，轉p35S+IR的煙草112株，轉pUbi+IR的煙草115株，轉pPNZIP+IR的煙草152株。
　　 4、以PVYN的病汁液為接種物，汁液摩擦接種轉基因煙草，對轉基因植株進行了抗病性分析。癥狀觀察及ELISA檢測表明，不同的轉基因植株對PVYN的抗性存在著差異。統(tǒng)計測定結果顯示，在轉pPNZIP+IR、p35S+IR、pUbi+IR的煙草中，PVY抗性植株的比例分別為83.54％、65.18％和2

5、4.33％。
　　 5、轉基因植株的Northern blot及siRNA的雜交分析表明，轉基因在RNA水平上都得到了表達，這種抗病性為RNA介導的抗病性，是RNA沉默的結果，但抗病性與siRNA的積累量二者并無相關性。
　　 6、啟動子活性檢測通過啟動子驅動GUS表達載體轉化煙草進行GUS活性分析。分別將約1800bp長度的GUS片段連在含有三個啟動子的雙元表達載體之后，轉化農桿菌，葉盤法轉化煙草，經卡那霉素篩選獲得若