利用熒光定量PCR技術(shù)分析捕食性天敵對(duì)大豆蚜的控害作用.pdf

1、大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）是近年來(lái)發(fā)生較為嚴(yán)重的大豆苗期害蟲(chóng)之一，由于化學(xué)防治造成的害蟲(chóng)抗藥性、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，加速了生物防治被推廣和應(yīng)用的進(jìn)程。在大豆蚜生物防治措施中，發(fā)揮天敵的控害作用是近幾年來(lái)最受關(guān)注的防治策略。利用大豆蚜捕食性天敵進(jìn)行生物防治首先要明確大豆蚜天敵的優(yōu)勢(shì)種群，在此基礎(chǔ)上量化評(píng)估天敵對(duì)大豆蚜有多大的捕食和控制能力，進(jìn)而制定出切實(shí)可行的防治措施。
　　 本研究在分析大豆蚜細(xì)胞色素

2、氧化酶Ⅱ（COⅡ）基因序列基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性引物，以大豆蚜成蟲(chóng)及取食過(guò)大豆蚜的捕食性天敵總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR獲得COⅡ基因的DNA片段，用T-A克隆方法將其裝載到質(zhì)粒pMD18-T載體上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取獲得標(biāo)準(zhǔn)品，并以此為模板梯度稀釋進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，建立檢測(cè)大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)田間捕食性天敵腹內(nèi)目標(biāo)害蟲(chóng)成分進(jìn)行檢測(cè)分析，最后擬合天敵發(fā)生數(shù)量、陽(yáng)性天敵比率、天敵體內(nèi)目標(biāo)害蟲(chóng)成分含量及目

3、標(biāo)害蟲(chóng)在天敵體內(nèi)衰變速率，綜合評(píng)價(jià)異色瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)、龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)、大草蛉幼蟲(chóng)和小花蝽幼蟲(chóng)對(duì)大豆蚜的控制能力，為大豆蚜的生物防治提供理論依據(jù)。
　　 本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下：
　　 1）設(shè)計(jì)合成大豆蚜特異性引物，驗(yàn)證該引物對(duì)大豆蚜及其同時(shí)期發(fā)生的其他蚜蟲(chóng)種類包括茄無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜、桃蚜、玉米蚜、禾谷縊管蚜、麥長(zhǎng)管蚜沒(méi)有擴(kuò)增效果，且電泳檢測(cè)結(jié)果顯示引物特異性良好，可用于熒光定量PCR反應(yīng)。
　　 2）利用PCR技術(shù)初步檢測(cè)捕食

4、性天敵對(duì)大豆蚜的捕食作用，在田間隨機(jī)采集的不同種類天敵，包括異色瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)及幼蟲(chóng)、龜紋瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)及幼蟲(chóng)、大草蛉成蟲(chóng)及幼蟲(chóng)、小花蝽成蟲(chóng)及幼蟲(chóng)，結(jié)果表明，在不同蟲(chóng)態(tài)上并不能完全檢測(cè)到大豆蚜COⅡ基因片段，以檢出率做為標(biāo)準(zhǔn)，同種天敵幼蟲(chóng)期對(duì)大豆蚜捕食作用檢出率較成蟲(chóng)期高，在所檢測(cè)的4種捕食性天敵類群及其不同蟲(chóng)態(tài)中，異色瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)、龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)、大草蛉幼蟲(chóng)及小花蝽成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)對(duì)大豆蚜的捕食作用檢出率分別為：80％、66.7％、73.3％、56％、60％

5、。
　　 3）成功構(gòu)建利用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大豆蚜COⅡ基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線及熔解曲線分析，結(jié)果表明目的基因拷貝數(shù)與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，反應(yīng)特異性較強(qiáng)，無(wú)引物二聚體出現(xiàn)，可用于其他樣品的檢測(cè)。
　　 4）利用熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序?qū)Σ妒承蕴鞌酬?yáng)性反應(yīng)個(gè)體體內(nèi)大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，異色瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)含有的大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)最大；其次為大草

6、蛉幼蟲(chóng)；再次為龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)；小花蝽幼蟲(chóng)體內(nèi)含有的大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)最少。
　　 5）檢測(cè)取食過(guò)大豆蚜自然消化不同時(shí)間的天敵體內(nèi)COⅡ基因衰變規(guī)律表明，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，可檢測(cè)到大豆蚜目的片段的陽(yáng)性個(gè)體數(shù)逐漸減少，并且捕食者體內(nèi)目的基因片段的拷貝數(shù)也隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。并計(jì)算出各天敵取食大豆蚜后消化時(shí)間對(duì)拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)關(guān)系式，異色瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食大豆蚜，自然消化0、2、4、6h后時(shí)間對(duì)拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：A=-0.6

7、517B+3.3024（R2=0.983）；龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食大豆蚜自然消化時(shí)間對(duì)拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：C=-0.4824D+3.2952（R2=0.965）；大草蛉幼蟲(chóng)取食大豆蚜自然消化時(shí)間對(duì)拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：E=-0.4715F+3.4319（R2=0.975）；小花蝽幼蟲(chóng)取食大豆蚜自然消化時(shí)間對(duì)拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：G=-0.4464H+3.2439（R2=0.939）。
　　 6）綜合考慮采集天敵數(shù)量、天敵