荔枝果實(shí)成熟過(guò)程中的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究以荔枝品種‘烏葉’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Wuye’)和‘下番枝’(Litchi chinensis Sonn.cv.‘Xiafanzhi’)果實(shí)為試驗(yàn)材料，利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)荔枝果實(shí)不同成熟時(shí)期進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。獲得了與荔枝果實(shí)成熟衰老相關(guān)的差異蛋白，并對(duì)部分差異蛋白進(jìn)行cDNA克隆及相對(duì)定量表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了適合荔枝果皮和假種皮中總蛋白質(zhì)提取的方法

2、和雙向電泳體系。以荔枝果皮和假種皮為材料，比較了TCA-丙酮、丙酮和酚3種提取方法在總蛋白產(chǎn)量、單向SDS-PAGE和雙向電泳等方面的區(qū)別，并對(duì)荔枝果皮和假種皮的雙向電泳體系進(jìn)行探索。結(jié)果表明，酚抽提法最佳，提取的總蛋白得率最高；所獲蛋白在單向SDS-PAGE中形成條帶數(shù)目最多，最清晰；經(jīng)雙向電泳分離用銀染顯色，2D圖譜分辨率較好，蛋白點(diǎn)清晰，主要分布在pH4-8，15.0-85.0 kD，可有效解析荔枝果皮和假種皮的蛋白質(zhì)組。

3、　　 2.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG膠條相結(jié)合的方法對(duì)‘烏葉’果皮不同成熟期進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮的成熟蛋白點(diǎn)數(shù)總體表現(xiàn)出先上升后下降的變化。其中，以階段Ⅲ檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)目最多，分別為753和937個(gè)，這個(gè)時(shí)期剛好處在荔枝果皮的轉(zhuǎn)色期；以階段Ⅵ完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白點(diǎn)數(shù)最少，分別為651和604個(gè)。從pH4-7膠條分離的蛋白中選取79個(gè)和pH3-10膠條分離的蛋白中選取28個(gè)，總107個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TO

4、F/TOF質(zhì)譜分析，獲得了107個(gè)完整的肽指紋圖譜，61個(gè)差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為57.0％。通過(guò)生物信息學(xué)分析，這些鑒定成功的已知蛋白參與了糖和能量代謝(29.51％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(11.48％)、基因表達(dá)調(diào)控(11.48％)、抗氧化(9.84％)、細(xì)胞代謝和周期調(diào)控(4.92％)、氨基酸代謝(4.92％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(4.92％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(1.64％)等生命活動(dòng)功能，功能未知的蛋白為21.31％。
　　

5、 3.采用18 cm pH4-7和pH3-10 IPG膠條相結(jié)合的方法對(duì)‘下番枝’果皮不同轉(zhuǎn)色期進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮轉(zhuǎn)色的進(jìn)程蛋白點(diǎn)數(shù)表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。其中，以果皮轉(zhuǎn)紅階段檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)目最多，分別為750和1106個(gè)，在果皮為青色期的蛋白點(diǎn)最少，分別為643和1041個(gè)。從pH4-7膠條分離的蛋白中選取55個(gè)和pH3-10膠條分離的蛋白中選取10個(gè)，總65個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，獲得了65個(gè)完整的肽指紋

6、圖譜，43個(gè)差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為66.15％。通過(guò)生物信息學(xué)分析，這些鑒定成功的蛋白參與了糖和能量代謝(20.93％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(16.28％)、基因表達(dá)調(diào)控(13.95％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(6.98％)、氨基酸代謝(6.98％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(6.98％)、次生代謝(4.65％)、抗氧化(4.65％)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)(2.33％)、激素相關(guān)(2.33％)等生命活動(dòng)功能，功能未知的蛋白為13.95％。
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7、.采用18 cm pH4-7膠條對(duì)‘烏葉’假種皮不同成熟期進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，隨著果皮轉(zhuǎn)色的進(jìn)程蛋白點(diǎn)數(shù)表現(xiàn)出先上升再下降的變化趨勢(shì)。其中，以階段Ⅲ檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)目最多1374個(gè)，這個(gè)時(shí)期剛好處在荔枝果實(shí)的轉(zhuǎn)色期；以階段Ⅵ果實(shí)完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白點(diǎn)數(shù)最少914個(gè)；其它時(shí)期檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)為：階段Ⅰ1144個(gè)、階段Ⅱ1330個(gè)、階段Ⅳ1096個(gè)、階段Ⅴ1012個(gè)。這與烏葉果皮轉(zhuǎn)色過(guò)程中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)的總體變化趨勢(shì)相似，在階段Ⅲ能檢測(cè)到的蛋白質(zhì)最多，在

8、階段Ⅵ完全轉(zhuǎn)紅期的蛋白質(zhì)最少。選取64個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，獲得了64個(gè)完整的肽指紋圖譜，43個(gè)差異蛋白獲得成功鑒定，成功率約為67.19％。通過(guò)生物信息學(xué)分析，這些鑒定成功的蛋白參與了糖和能量代謝(27.91％)、蛋白質(zhì)合成和代謝以及穩(wěn)定(11.63％)、氨基酸代謝(6.98％)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和周期調(diào)控(6.98％)、基因表達(dá)調(diào)控(4.65％)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(9.3％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(4.65％)、抗氧化(4.65％

9、)、次生代謝(4.65％)等生命活動(dòng)功能，功能未知的蛋白為18.6％。
　　 5.荔枝果實(shí)成熟過(guò)程中部分相關(guān)蛋白的基因克隆及其在果皮中的表達(dá)。
　　 ①克隆了荔枝果皮Actin1基因的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1418 bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有1134 bp，編碼377個(gè)氨基酸。Actin1在荔枝果皮不同成熟期的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，變化不大。因此，在研究熒光定量表達(dá)分析中，所克隆的Actin1基因可

10、作為其它目的基因的內(nèi)參基因。
　　 ②克隆了荔枝果皮UFGT基因的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1577 bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有1362 bp，編碼453個(gè)氨基酸。荔枝果皮UFGT基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷上升變化，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 ③克隆了荔枝果皮OEE1基因的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1217 bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有1002 bp，編碼333個(gè)氨基酸。荔枝

11、果皮OEE1基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷下降變化，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 ④克隆了荔枝果皮rbcs基因的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)868 bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有567 bp，編碼188個(gè)氨基酸。荔枝果皮rbcs基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷下降變化，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 ⑤克隆了荔枝果皮Aconitase基因的cDNA序列，該片段序列長(zhǎng)

12、2945 bp，編碼883個(gè)氨基酸。荔枝果皮Aconitase基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈不斷上升變化，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 ⑥克隆了荔枝果皮ASR基因的cDNA序列，該片段序列長(zhǎng)515 bp，編碼99個(gè)氨基酸。荔枝果皮ASR基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降的變化，在階段Ⅱ的表達(dá)量最高，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　 ⑦克隆了荔枝果皮TCTP基因的cD

13、NA序列，該序列全長(zhǎng)848bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有507 bp，編碼168個(gè)氨基酸。荔枝果皮TCTP基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降再上升的變化，與其在果皮成熟過(guò)程中的蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)不太一致。
　　 ⑧克隆了荔枝果皮14-3-3基因的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1084 bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)共有792 bp，編碼261個(gè)氨基酸。荔枝果皮14-3-3基因在轉(zhuǎn)錄水平隨著果皮著色的加深呈先上升后下降再上