雞卵泡發(fā)育相關(guān)基因和miRNA的鑒定及功能分析.pdf

1、動(dòng)物育種實(shí)踐證明，性早熟性狀可以遺傳，可能存在控制性早熟的主效基因，因此利用性早熟地方雞品種篩選性早熟相關(guān)基因，可用于動(dòng)物培育性早熟高繁殖力的品種以及為人類性早熟疾病的控制和治療提供參考。動(dòng)物性成熟是一個(gè)受多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，在哺乳動(dòng)物進(jìn)行了大量研究，但禽類相對(duì)較少。雞的卵泡在發(fā)育成熟過程中有嚴(yán)格的等級(jí)性，卵泡一旦經(jīng)過選擇后就按等級(jí)發(fā)育直至排卵，且很少發(fā)生閉鎖。提高進(jìn)入優(yōu)勢化等級(jí)的卵泡數(shù)量對(duì)于提高雞的產(chǎn)蛋性能具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。目前對(duì)

2、雞卵泡優(yōu)勢化選擇及等級(jí)化維持的分子機(jī)制大多仍不清楚。哺乳動(dòng)物研究表明，有多種生長因子以自分泌/旁分泌的方式在促性腺激素協(xié)同下參與了卵泡發(fā)育調(diào)控。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的具有許多調(diào)控功能的一類非編碼小分子RNA，其在哺乳動(dòng)物卵巢中的表達(dá)特征已有報(bào)道，但在禽類卵巢的表達(dá)及功能研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)雞卵泡發(fā)育相關(guān)基因及miRNA進(jìn)行了鑒定和功能分析。
　　 一、雞FSHR基因5’調(diào)控區(qū)-237和-868兩個(gè)突變位點(diǎn)的多態(tài)性及功能分析

3、
　　 促卵泡素（FSH）是調(diào)控動(dòng)物繁殖活動(dòng)的重要激素之一，對(duì)動(dòng)物卵巢卵泡的生長、發(fā)育、分化、成熟和排卵起著必不可少的作用，其生物學(xué)功能的發(fā)揮要通過位于靶細(xì)胞膜上的促卵泡素受體（FSHR）介導(dǎo)，研究FSHR5’調(diào)控區(qū)突變與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系，尋找繁殖相關(guān)的DNA分子標(biāo)記，對(duì)于禽類育種實(shí)踐將有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究用5個(gè)品種分析了突變位點(diǎn)的基因型分布，用2個(gè)雞品種共計(jì)943個(gè)個(gè)體進(jìn)行了突變位點(diǎn)基因型和單倍型的檢測以及

4、與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)突變位點(diǎn)TTG+G+、TTG+G-和TTG-G-三種不同基因型間FSHR mRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析，構(gòu)建4種單倍型載體，體外轉(zhuǎn)染雞的卵泡顆粒細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對(duì)其啟動(dòng)基因表達(dá)的效率進(jìn)行了分析。5個(gè)品種比較的結(jié)果表明：-868位點(diǎn)200 bp缺失型（G-）頻率在地方品種達(dá)90％以上；文昌雞群體單位點(diǎn)多態(tài)與39 w產(chǎn)蛋數(shù)和開產(chǎn)日齡相關(guān)不顯著，兩位點(diǎn)雙倍型分析結(jié)果與開產(chǎn)日齡相關(guān)密

5、切，TTG+G-對(duì)應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡（123 d），TTG+G+對(duì)應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡（134 d），兩者差異顯著（P=0.016）。新楊褐群體在-237位點(diǎn)為TT型時(shí)-868位點(diǎn)與37 w產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)顯著（P<0.05）：G-型對(duì)應(yīng)較早開產(chǎn)日齡，但G+型對(duì)應(yīng)較高的后期產(chǎn)蛋數(shù)；熒光定量結(jié)果也表明，高峰期G+G+型FSHR mRNA的表達(dá)量最高（P<0.05）。熒光素酶的分析結(jié)果表明，AG-型的啟動(dòng)效率最高，顯著高于TG+、TG-單倍型（P=0.

6、015）。推測G-型可能與早開產(chǎn)有關(guān)，這與G-在開產(chǎn)較早的地方品種中的頻率較高相一致，G+型與高的產(chǎn)蛋數(shù)有關(guān)，其在高產(chǎn)群體中頻率較高，兩位點(diǎn)間的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。
　　 二、TNRC6A（又稱GW182）參與RNAi（RNA干擾）和miRNA途徑，與mRNA、Argonaute等蛋白聚集在細(xì)胞質(zhì)小體（P body或GW-body），參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本研究分析了TNRC6A基因在下丘腦、輸卵管、肝臟及卵巢和卵泡發(fā)育不同時(shí)

7、期的表達(dá)規(guī)律。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，TNRC6A mRNA在17 w自來航雞卵巢比23 w開產(chǎn)后卵巢的表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)，而在下丘腦、肝臟及輸卵管中則上調(diào)表達(dá)（P<0.05）。在直徑4 mm的白卵泡中表達(dá)量最高，且跟其它幾級(jí)卵泡差異顯著（P<0.05），在直徑6-8mm的黃卵泡中表達(dá)量最低，之后隨卵泡直徑的增大而呈增高趨勢，在排卵前最大的F1卵泡中表達(dá)量又有所下降，但從黃卵泡到F1卵泡TNRC6A mRNA表達(dá)量差異不顯著。
　　

8、三、cDNA.-FLP技術(shù)是一種新的研究基因差異表達(dá)的技術(shù)，具有可靠性高、重復(fù)性好、假陽性率低、不需要預(yù)先知道序列信息及所需儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛用于生物基因表達(dá)特性的研究。本研究用cDNA-AFLP方法，以具有性早熟特性的濟(jì)寧百日雞為試驗(yàn)材料，篩選與性早熟有關(guān)的基因。使用EcoRI和MseI雙酶切組合，用54對(duì)不同的引物組合擴(kuò)增出403個(gè)差異顯示片段，經(jīng)差異帶挖取，二次擴(kuò)增，膠回收純化及克隆測序后，得到27個(gè)與GenBank數(shù)據(jù)

9、庫高度同源的差異表達(dá)序列。
　　 選擇可能與繁殖有關(guān)的13個(gè)差異顯示基因進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證，最終獲得5個(gè)在表達(dá)量上有顯著差異的基因，其中有4個(gè)差異基因在開產(chǎn)的卵巢中表達(dá)上調(diào)，功能分析發(fā)現(xiàn)CCT6A與孕酮的產(chǎn)生有關(guān)，ERCC8基因所編碼的蛋白是miRNA的靶蛋白，ZNF183是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的重要轉(zhuǎn)錄因子，最初在爪蟾卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Poly（A）polymeraseⅡ?qū)τ诼涯讣?xì)胞的成熟有重要作用。在開產(chǎn)的卵巢明顯下調(diào)的LOC4188

10、83，其功能類似于酵母的vacuolar protein sorting36，下一步將對(duì)這些在性成熟前后卵巢中存在明顯表達(dá)差異基因的功能進(jìn)行深入探討。
　　 四、采用Solexa測序技術(shù)分析了開產(chǎn)前后雞卵巢差異表達(dá)的mRNA。采集3只42 d雛雞和3只23 w產(chǎn)蛋白來航雞的卵巢組織，混池測序，結(jié)果在開產(chǎn)的卵巢共篩選到差異表達(dá)的mRNA3648個(gè)，其中有2088個(gè)呈下調(diào)表達(dá)，1560個(gè)呈上調(diào)表達(dá)，對(duì)測得的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析驗(yàn)證，

11、為篩選性成熟相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。
　　 五、采用Solexa測序技術(shù)分析了開產(chǎn)前后雞卵巢差異表達(dá)的miRNA。采集3只42d雛雞和3只23 w產(chǎn)蛋白來航雞的卵巢組織，混池測序，結(jié)果共篩選到72個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中34個(gè)上調(diào)表達(dá)，38個(gè)下調(diào)表達(dá)。在未開產(chǎn)雞的卵巢中篩選到189個(gè)新miRNA，在開產(chǎn)雞的卵巢中篩選到97個(gè)新miRNA。對(duì)獲得的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行分析驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究miRNA在雞卵泡發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。