豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體制備及免疫原性研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine Reproductive and Respiration Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。PRRSV基因組中的ORF2～7基因分別編碼病毒的GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中N蛋白免疫原性最強(qiáng),為本病毒的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)蛋白,而且在病毒粒子中含量最多,為診斷PRRS的首選蛋白。
　　 本試驗(yàn)將

2、PRRSV在Marc—145細(xì)胞上培養(yǎng),收獲病毒液,經(jīng)高速離心得到了純化的PRRSV,通過紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白含量為1.35mg/mL。將濃縮純化病毒滅活,通過棋盤法確定抗原的最佳包被含量為2.438μg/mL,同時(shí)優(yōu)化各步反應(yīng)條件,建立了可以檢測(cè)PRRSV抗體的間接ELISA方法。
　　 將純化的PRRSV與等量弗氏佐劑乳化,按110μg/只的劑量經(jīng)皮下免疫接種BALB/C小鼠,每隔2周1次,共5次,待血清抗體效價(jià)達(dá)到

3、1:6400以上后,再腹腔注射330μg純抗原進(jìn)行超強(qiáng)免疫。3天后無菌取小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞,將其按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,待融合細(xì)胞鋪滿孔底1/3時(shí),用建立的間接ELISA方法檢測(cè),篩選陽性克隆細(xì)胞株。用有限稀釋法將陽性克隆細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆,經(jīng)SDS—PAGE和Western blot鑒定得到了兩株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白的抗體的陽性克隆細(xì)胞株,分別命名為AD10和BC12。陽性克隆細(xì)胞株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,取約含4～6×106個(gè)細(xì)

4、胞的細(xì)胞懸液注入小鼠腹腔,12天后收取腹水,應(yīng)用建立的間接ELISA方法測(cè)定,抗體效價(jià)為1:160。
　　 將純化PRRSV抗原分成兩部分,一部分用甲醛處理,另一部分不用甲醉處理,分別與等量弗氏佐劑乳化后制備成免疫抗原。將20只小鼠隨機(jī)分成A、B、C、D四組,每組5只,按110μg/只的劑量經(jīng)皮下免疫接種小鼠,A組和B組分別用處理和朱處理抗原各免疫1次,C組和D組分別用處理和朱處理抗原各免疫2次,間隔7天1次。免疫后每隔7天進(jìn)行

5、一次尾靜脈采血,分別剛可以檢測(cè)抗PRRSV,GP5、M和N蛋白抗體的間接ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明4個(gè)試驗(yàn)組的免疫小鼠都可以產(chǎn)生針對(duì)PRRSV及各結(jié)構(gòu)蛋白的抗體,抗N蛋白的抗體產(chǎn)生最早,免疫后14天出現(xiàn),2l天后抗體效價(jià)達(dá)到1:1280；抗M蛋白的抗體在免疫后42天山現(xiàn),抗體效價(jià)達(dá)到1:80,抗GP5蛋白的抗體在免疫后49天出現(xiàn),抗體效價(jià)達(dá)到1:80。二次免疫比一次免疫抗體效價(jià)總體略微偏高,用甲醛處理的病毒免疫而產(chǎn)生的抗體效價(jià)略微偏高