小鼠胚胎成纖維細胞體外培養(yǎng)與生長特性的研究.pdf

1、飼養(yǎng)層(feeder layer)是特定的細胞(如成纖維細胞、輸卵管上皮細胞、子宮上皮細胞、胎兒睪丸細胞等)經(jīng)絲裂霉素-C阻斷有絲分裂處理后制成的單層細胞。目前，大多數(shù)實驗室均采用小鼠成纖維細胞(MEF和STO細胞)作為飼養(yǎng)層分離培養(yǎng)胚胎干細胞(ES)。飼養(yǎng)層的存在不僅為Es細胞的生長繁殖提供了一個穩(wěn)定的外環(huán)境，同時也維持了ES細胞無限增殖與分化的特性。然而衰老的飼養(yǎng)層會對ES細胞產(chǎn)生負面影響，死亡的飼養(yǎng)層細胞會釋放一些DNA碎片和溶酶

2、體的酶進入培養(yǎng)液，干擾了ES細胞的生長和正常核型的維持。本研究利用3種不同的冷凍方法對小鼠胚胎成纖維細胞進行凍存，篩選出最佳的冷凍方案。并對小鼠胚胎成纖維細胞在連續(xù)傳代過程中細胞活力以及細胞骨架所發(fā)生的變化進行追蹤觀察，確定制作飼養(yǎng)層的最佳時機。 本試驗首先以12.5d的昆明小鼠胚胎和STO細胞為材料，對MEF進行了分離培養(yǎng)。并通過3種冷凍方法對STO細胞和MEF細胞分別進行冷凍，即方法A為將細胞在冰箱中平衡1h后放入-20℃冰

3、箱中過夜，次日轉移至液氮中；方法B為將細胞迅速放入-70℃冰箱過夜，次日轉移至液氮中：方法C為將細胞置于液氮面上5-10cm處薰蒸20min后緩緩降入液氮中。細胞凍融后再以存活率(臺盼藍染色實驗)為主，輔以細胞相對活力測定(MTT法檢測)和冷凍前后的細胞形態(tài)比較，對這3種方法的冷凍效果作以比較。以其為小鼠成纖維細胞的保存提供依據(jù)。然后對STO細胞和MEF細胞進行了連續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學變化，采用MTT法檢測其細胞活力，并繪制了細胞生長曲

4、線；對不同代次的小鼠胚胎成纖維細胞進行免疫熒光染色，觀察其細胞骨架的變化。結果表明： 1．采用方法B凍存的細胞存活率明顯高于方法A和方法C，同時不同冷凍方法對細胞生長形態(tài)、相對活力的影響無明顯差異，并推斷出該實驗中方法B為飼養(yǎng)層細胞冷凍最佳方案。 2．STO細胞在解凍后，最初幾代生長較快，胞體成典型的成纖維細胞形態(tài)，隨傳代次數(shù)的增加，特別是9代以后，細胞逐漸排列不規(guī)則，胞內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒和空泡，死細胞增加。14代以后，部分

5、細胞出現(xiàn)胞質(zhì)溶解，胞體破碎等現(xiàn)象。MEF細胞在分離培養(yǎng)后，在最初幾代生長緩慢，貼壁細胞較少；4代后生長迅速，代謝旺盛，細胞形狀規(guī)則，到6代以后，細胞急劇衰亡，細胞出現(xiàn)解體，有成片的細胞漂浮或懸浮在培養(yǎng)液中。 3．解凍后的STO細胞在第5代細胞活力達到最大值，第9代出現(xiàn)下降，傳至14代又有升高。MEF分離培養(yǎng)后，細胞活力先出現(xiàn)下降，隨后上升，第5代細胞活力達最大值，6代以后細胞活力急劇下降。 4．經(jīng)激光共聚焦顯微術觀察發(fā)現(xiàn)