斜紋夜蛾核型多角體病毒ⅡORF50基因的研究.pdf

1、斜紋夜蛾屬鱗翅目夜蛾科,是嚴(yán)重危害包括水稻、玉米、棉花等共計(jì)109科389種農(nóng)作物的害蟲(chóng)。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)并鑒定出一種全新的以斜紋夜蛾為特異性宿主的桿狀病毒種,命名為斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ(SpltNPVⅡ),其繁殖率和毒性極強(qiáng),殺蟲(chóng)時(shí)間短,而且BV在蟲(chóng)體內(nèi)的增值速率最快,具有作為生物殺蟲(chóng)劑所具有的優(yōu)良特性和潛力。斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ(SpltNPVⅡ)中的146個(gè)開(kāi)讀框(OpenReading Frame,ORF)中,ORF50最為特殊,

2、在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)研究報(bào)道,是新型未知基因。NCBI在線BLAST比對(duì)未發(fā)現(xiàn)與與ORF50有相似度的基因。將ORF50編碼蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,ORF50的編碼蛋白序列沒(méi)有保守序列,目前還沒(méi)有任何與之相似度大于30％的蛋白序列。
　　 本研究通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析SpltNPVⅡ的包埋型病毒(ODV)和芽生型病毒(BV)組成蛋白差異,結(jié)果中均可檢測(cè)到ORF5O的編碼蛋白gp50的存在,而且相比較在BVs

3、組成型蛋白中的gp50存在檢測(cè)分值要比ODV中高,因?yàn)镾pltNPVⅡ的BV在蟲(chóng)體內(nèi)的增值速率最快,推測(cè)gp50可能與BV在蟲(chóng)體內(nèi)對(duì)周圍細(xì)胞的感染有著重要作用。以pGL3-Basic對(duì)ORF50的前導(dǎo)序列50P進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析,在未加誘導(dǎo)因子的情況下,重組載體能夠順利表達(dá)螢光素酶,在熒光底物的存在下,能夠產(chǎn)生熒光,而且其光量子強(qiáng)度均值達(dá)到18456,與陰性對(duì)照217差異極大,由此可以確定50P啟動(dòng)子為SpltNPVⅡ的早期啟動(dòng)子。分別

4、合成各感染時(shí)相cDNA,以引物50P1:5’ttgaaagacgacggtgtgt3’,50P2:5'ctattcgacatgagcaacaatctg3’,25μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,ORF50在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h均有轉(zhuǎn)錄。根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物,50P3:5'-gtcgatgaagaggtctggcaatac-3’；50P4:5'-ctcttcgttcataatcatgtcgtg

5、c-3’,以提取RNA稀釋到等量作為本底參照,進(jìn)行熒光定量PCR分析,結(jié)果與RT-PCR一致。以等量的各個(gè)時(shí)期的總蛋白為抗原,豚鼠面議純化蛋白為一抗,羊抗豚鼠抗原為二抗,進(jìn)行蛋白免疫印跡(western blotting)檢測(cè)表達(dá)時(shí)相分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 h、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h等時(shí)相總蛋白中均能夠檢測(cè)到ORF50編碼蛋白gp50的存在。結(jié)合RT-PCR,熒光定量PCR、蛋白免疫印跡(western blottin