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文檔簡(jiǎn)介
1、繁殖力是影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的最重要因素之一,是決定養(yǎng)豬業(yè)效益高低的主要限制因素。繁殖力的高低取決于母體卵巢卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育,因?yàn)槁雅莅l(fā)育決定了排卵數(shù),是影響繁殖力的關(guān)鍵因素。掌握母豬卵泡發(fā)育規(guī)律及其影響因素有利于進(jìn)一步提高母豬繁殖能力,提高豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育是十分復(fù)雜的過程,主要包括:原始卵泡的募集、腔前卵泡的發(fā)育、有腔卵泡的選擇和生長(zhǎng)及卵泡的成熟或閉鎖。隨著后基因組信息學(xué)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的、非獨(dú)立
2、生理生化過程,受多種相同或者不同的細(xì)胞內(nèi)、外因子及信號(hào)通路的影響和控制。
卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞,它對(duì)卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育有至關(guān)重要的作用。伴隨著哺乳動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育,顆粒細(xì)胞體積增大、數(shù)量增多及逐步分化和成熟。BMPs(bone morphogenetic proteins,BMPs)屬于TGF-β超家族成員,近幾年,研究人員對(duì)BMPs在繁殖上的作用進(jìn)行了廣泛的研究,包括卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的
3、增殖與凋亡、類固醇激素的合成、卵母細(xì)胞成熟、排卵和黃體化等。但BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中具體作用及機(jī)制目前尚未見報(bào)道。因此,深入研究BMP/Smad信號(hào)通路在卵泡發(fā)育過程顆粒細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制,可以為哺乳動(dòng)物繁殖性狀的選育提供可能的理論基礎(chǔ),在提高家畜繁殖性能方面有重要意義。
本研究以豬卵泡顆粒細(xì)胞(GCs)為實(shí)驗(yàn)材料,采用real time RT-PCR方法檢測(cè)BMP/Smad信號(hào)通路中關(guān)鍵因子(受
4、體和下游信號(hào)分子)在豬卵泡不同發(fā)育時(shí)期的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平;利用免疫組織化學(xué)方法就BMP/Smad信號(hào)通路核心下游信號(hào)分子-Smad4,在豬卵巢中的細(xì)胞定位進(jìn)行研究;用RNAi方法敲減Smad4,以阻抑BMP/Smad信號(hào)通路,利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA,real time RT-PCR等方法檢測(cè)阻抑該信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制;在阻抑通路的基礎(chǔ)上,額外添加FSH,利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA、real ti
5、me RT-PCR等方法檢測(cè)阻抑該信號(hào)通路對(duì)FSH影響豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用的影響;用BMP配體(BMP-6)激活BMP/Smad信號(hào)通路,用RNAi方法敲減Smad4,以阻抑該通路,分別利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA等方法檢測(cè)兩種條件下體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞的存活率、細(xì)胞周期、類固醇激素分泌水平等,并采用高通量基因芯片技術(shù),對(duì)阻抑信號(hào)通路和阻抑后激活信號(hào)通路的豬卵泡顆粒細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較研究,
主要研究結(jié)果
6、如下:
1用real time RT-PCR法檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期豬卵泡顆粒細(xì)胞中BMP/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵因子(BMP受體和Smads)表達(dá)情況,結(jié)果表明:BMP受體和Smads在豬卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),并且ActR1A和BMPR2 mRNA在大卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于小卵泡(P<0.05)。BMPR1A、ActR2、Smad1、Smad5和Smad8在卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)有增加趨勢(shì),但差異不顯著。相反,BMPR
7、1B、Smad4和Smad7的表達(dá)有一定程度的下降。這表明BMP/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子在豬卵泡發(fā)育階段特異性表達(dá),在卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)與分化過程中起重要的調(diào)控作用。
2用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Smad4在豬卵巢組織中的定位與表達(dá),結(jié)果顯示,Smad4在豬卵泡的多個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞中均有表達(dá)。在原始卵泡中和初級(jí)卵泡中,Smad4在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),而在顆粒細(xì)胞中沒有表達(dá);在腔前卵泡中,Smad4蛋白在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中
8、均有表達(dá),在有腔卵泡中,Smad4蛋白主要被定位到顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中,而卵母細(xì)胞中表達(dá)較弱。
3為了研究BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的作用,本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)?;赟mad4在該通路中的核心地位,采用RNAi技術(shù)“沉默”豬Smad4基因,阻抑BMP/Smad信號(hào)通路,以檢測(cè)阻抑該通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和類固醇激素分泌的影響。結(jié)果表明:采用的RNAi技
9、術(shù)成功的“敲減”豬Smad4基因,在mRNA水平該基因被下調(diào)89%,蛋白水平被下調(diào)56.6%。建立了BMP/Smad信號(hào)通路阻抑的細(xì)胞模型。阻抑該通路能顯著抑制細(xì)胞的增殖,增加G1期細(xì)胞的百分含量,減少S期的細(xì)胞,并能顯著下調(diào)細(xì)胞增殖標(biāo)志因子Cyclin D2和CDK4的mRNA表達(dá)。阻抑該通路能顯著增加顆粒細(xì)胞的凋亡比率,下調(diào)Bcl-2的表達(dá),但不影響B(tài)ax的表達(dá)。阻抑該通路能顯著抑制雌二醇的分泌,并下調(diào)P450arom mRNA的表
10、達(dá),表明BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中有重要的調(diào)控作用。
4為研究BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)FSH誘導(dǎo)豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響,本研究在阻抑BMP/Smad信號(hào)通路的細(xì)胞中添加FSH。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期變化、CLIA方法檢測(cè)雌二醇和孕酮的分泌以及real time RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明:阻抑信號(hào)通路下調(diào)FSH受體的表達(dá),阻抑信號(hào)通路使FSH促進(jìn)細(xì)胞增殖的作
11、用減弱,阻抑信號(hào)通路能顯著增加G1期的細(xì)胞比率,即使添加FSH;阻抑通路能降低Cyclin D2的表達(dá),且能抑制FSH促進(jìn)其表達(dá);阻抑信號(hào)通路能抑制CDK4的表達(dá),即使添加FSH;阻抑信號(hào)通路能降低FSH誘導(dǎo)細(xì)胞分泌雌二醇的能力,但對(duì)孕酮沒有影響。阻抑信號(hào)通路能減少P450arom的表達(dá),并且降低FSH對(duì)其表達(dá)的影響;阻抑信號(hào)通路抑制FSH對(duì)P450scc表達(dá)的影響。
5為研究BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響
12、,基于Smad4在該通路中的核心地位,采用RNAi技術(shù)“沉默”豬Smad4基因,阻抑BMP/Smad信號(hào)通路,另一方面,添加BMP配體(BMP-6)激活該通路,分別觀察阻抑和/或激活BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果表明:阻抑通路顯著抑制細(xì)胞的增殖,增加G1期的細(xì)胞,減少S期細(xì)胞;激活通路則促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),減少G1期細(xì)胞,增加S期細(xì)胞,阻抑信號(hào)通路能抑制雌二醇的合成,對(duì)孕酮沒有顯著影響,激活該通路抑制兩種類固醇激素的分泌
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