BMP-Smad信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響.pdf

1、繁殖力是影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的最重要因素之一，是決定養(yǎng)豬業(yè)效益高低的主要限制因素。繁殖力的高低取決于母體卵巢卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，因?yàn)槁雅莅l(fā)育決定了排卵數(shù)，是影響繁殖力的關(guān)鍵因素。掌握母豬卵泡發(fā)育規(guī)律及其影響因素有利于進(jìn)一步提高母豬繁殖能力，提高豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育是十分復(fù)雜的過程，主要包括：原始卵泡的募集、腔前卵泡的發(fā)育、有腔卵泡的選擇和生長(zhǎng)及卵泡的成熟或閉鎖。隨著后基因組信息學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的、非獨(dú)立

2、生理生化過程，受多種相同或者不同的細(xì)胞內(nèi)、外因子及信號(hào)通路的影響和控制。
　　 卵泡顆粒細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞，它對(duì)卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育有至關(guān)重要的作用。伴隨著哺乳動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育，顆粒細(xì)胞體積增大、數(shù)量增多及逐步分化和成熟。BMPs(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于TGF-β超家族成員，近幾年，研究人員對(duì)BMPs在繁殖上的作用進(jìn)行了廣泛的研究，包括卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的

3、增殖與凋亡、類固醇激素的合成、卵母細(xì)胞成熟、排卵和黃體化等。但BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中具體作用及機(jī)制目前尚未見報(bào)道。因此，深入研究BMP/Smad信號(hào)通路在卵泡發(fā)育過程顆粒細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制，可以為哺乳動(dòng)物繁殖性狀的選育提供可能的理論基礎(chǔ)，在提高家畜繁殖性能方面有重要意義。
　　 本研究以豬卵泡顆粒細(xì)胞(GCs)為實(shí)驗(yàn)材料，采用real time RT-PCR方法檢測(cè)BMP/Smad信號(hào)通路中關(guān)鍵因子(受

4、體和下游信號(hào)分子)在豬卵泡不同發(fā)育時(shí)期的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平；利用免疫組織化學(xué)方法就BMP/Smad信號(hào)通路核心下游信號(hào)分子-Smad4，在豬卵巢中的細(xì)胞定位進(jìn)行研究；用RNAi方法敲減Smad4，以阻抑BMP/Smad信號(hào)通路，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA，real time RT-PCR等方法檢測(cè)阻抑該信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制；在阻抑通路的基礎(chǔ)上，額外添加FSH，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA、real ti

5、me RT-PCR等方法檢測(cè)阻抑該信號(hào)通路對(duì)FSH影響豬卵泡顆粒細(xì)胞的作用的影響；用BMP配體(BMP-6)激活BMP/Smad信號(hào)通路，用RNAi方法敲減Smad4，以阻抑該通路，分別利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、CLIA等方法檢測(cè)兩種條件下體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞的存活率、細(xì)胞周期、類固醇激素分泌水平等，并采用高通量基因芯片技術(shù)，對(duì)阻抑信號(hào)通路和阻抑后激活信號(hào)通路的豬卵泡顆粒細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較研究，
　　 主要研究結(jié)果

6、如下：
　　 1用real time RT-PCR法檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期豬卵泡顆粒細(xì)胞中BMP/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵因子(BMP受體和Smads)表達(dá)情況，結(jié)果表明：BMP受體和Smads在豬卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，并且ActR1A和BMPR2 mRNA在大卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于小卵泡(P<0.05)。BMPR1A、ActR2、Smad1、Smad5和Smad8在卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)有增加趨勢(shì)，但差異不顯著。相反，BMPR

7、1B、Smad4和Smad7的表達(dá)有一定程度的下降。這表明BMP/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵因子在豬卵泡發(fā)育階段特異性表達(dá)，在卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)與分化過程中起重要的調(diào)控作用。
　　 2用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Smad4在豬卵巢組織中的定位與表達(dá)，結(jié)果顯示，Smad4在豬卵泡的多個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞中均有表達(dá)。在原始卵泡中和初級(jí)卵泡中，Smad4在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而在顆粒細(xì)胞中沒有表達(dá)；在腔前卵泡中，Smad4蛋白在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中

8、均有表達(dá)，在有腔卵泡中，Smad4蛋白主要被定位到顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞中，而卵母細(xì)胞中表達(dá)較弱。
　　 3為了研究BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的作用，本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)?；赟mad4在該通路中的核心地位，采用RNAi技術(shù)“沉默”豬Smad4基因，阻抑BMP/Smad信號(hào)通路，以檢測(cè)阻抑該通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和類固醇激素分泌的影響。結(jié)果表明：采用的RNAi技

9、術(shù)成功的“敲減”豬Smad4基因，在mRNA水平該基因被下調(diào)89％，蛋白水平被下調(diào)56.6％。建立了BMP/Smad信號(hào)通路阻抑的細(xì)胞模型。阻抑該通路能顯著抑制細(xì)胞的增殖，增加G1期細(xì)胞的百分含量，減少S期的細(xì)胞，并能顯著下調(diào)細(xì)胞增殖標(biāo)志因子Cyclin D2和CDK4的mRNA表達(dá)。阻抑該通路能顯著增加顆粒細(xì)胞的凋亡比率，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，但不影響B(tài)ax的表達(dá)。阻抑該通路能顯著抑制雌二醇的分泌，并下調(diào)P450arom mRNA的表

10、達(dá)，表明BMP/Smad信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中有重要的調(diào)控作用。
　　 4為研究BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)FSH誘導(dǎo)豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響，本研究在阻抑BMP/Smad信號(hào)通路的細(xì)胞中添加FSH。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期變化、CLIA方法檢測(cè)雌二醇和孕酮的分泌以及real time RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明：阻抑信號(hào)通路下調(diào)FSH受體的表達(dá)，阻抑信號(hào)通路使FSH促進(jìn)細(xì)胞增殖的作

11、用減弱，阻抑信號(hào)通路能顯著增加G1期的細(xì)胞比率，即使添加FSH；阻抑通路能降低Cyclin D2的表達(dá)，且能抑制FSH促進(jìn)其表達(dá)；阻抑信號(hào)通路能抑制CDK4的表達(dá)，即使添加FSH；阻抑信號(hào)通路能降低FSH誘導(dǎo)細(xì)胞分泌雌二醇的能力，但對(duì)孕酮沒有影響。阻抑信號(hào)通路能減少P450arom的表達(dá)，并且降低FSH對(duì)其表達(dá)的影響；阻抑信號(hào)通路抑制FSH對(duì)P450scc表達(dá)的影響。
　　 5為研究BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞的影響

12、，基于Smad4在該通路中的核心地位，采用RNAi技術(shù)“沉默”豬Smad4基因，阻抑BMP/Smad信號(hào)通路，另一方面，添加BMP配體(BMP-6)激活該通路，分別觀察阻抑和/或激活BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果表明：阻抑通路顯著抑制細(xì)胞的增殖，增加G1期的細(xì)胞，減少S期細(xì)胞；激活通路則促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，減少G1期細(xì)胞，增加S期細(xì)胞，阻抑信號(hào)通路能抑制雌二醇的合成，對(duì)孕酮沒有顯著影響，激活該通路抑制兩種類固醇激素的分泌