藥劑脅迫下朱砂葉螨酯酶基因的表達(dá)特征.pdf

1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)是一種為害嚴(yán)重而又難以防治的重要農(nóng)業(yè)害螨，在我國分布廣泛，對(duì)包括棉花、多種蔬菜在內(nèi)的許多植物都有危害。該螨世代周期短，繁殖力強(qiáng)，近親交配率高，受藥機(jī)會(huì)多，很容易產(chǎn)生抗藥性。酯酶作為一種水解酶，能夠水解羧酸酯鍵和磷酸酯鍵，代謝多種含有酯鍵的殺蟲劑，是害蟲產(chǎn)生抗性的主要因素之一。
　　 本研究在前人已經(jīng)克隆得到朱砂葉螨酯酶基因TCE1,TCE2的基礎(chǔ)上，建立了適于定量檢測(cè)朱

2、砂葉螨mRNA表達(dá)的real-time PCR方法，并用該方法檢測(cè)了酯酶基因TCE1和TCE2的mRNA分別在朱砂葉螨不同發(fā)育時(shí)期(卵、幼螨、若螨和成螨)、不同品系(阿維菌素、甲氰菊酯、氧化樂果抗性品系和敏感品系)以及藥劑(阿維菌素、甲氰菊酯、氧化樂果)誘導(dǎo)前后的表達(dá)差異，從基因水平探討了朱砂葉螨酯酶基因的表達(dá)變化與其抗藥性形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。此外，還成功構(gòu)建了酯酶TCE1，TCE2基因的重組原核表達(dá)載體pET43a-TCE1，pET4

3、3a-TCE2，且在E.coli Transetta中成功進(jìn)行了蛋白表達(dá)。本研究獲得的主要成果如下：
　　 ⑴利用RT-PCR技術(shù)，從朱砂葉螨體內(nèi)獲得了七條候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增片段，并提交到GenBank，取得相應(yīng)的登錄號(hào)分別為RPS18(FJ608659)：262bp，5.8SrRNA(FJ526334)：470bp，GAPDH(FJ526335)：293bp，RPL13a(FJ608662)：242bp，TBP(FJ60866

4、1)：365bp，SDHA(FJ608660)：594bp，α-TUB(FJ526336)：962bp。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法并使用geNorm和NormFinder兩個(gè)軟件共同篩選最適合朱砂葉螨的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因篩選結(jié)果為：5.8s rRNA，α-TUB，RPS18，GAPDH，RPL13a,β-actin表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M在不同品系中依次為0.381，0.449.0.352，0.460，0.445，0.643，表達(dá)穩(wěn)定度由高

5、到低排序依次為RPS18＞5.8srRNA＞RPL13a＞0.449＞GAPDH＞β-actin；M值在不同螨態(tài)中依次為0.762，0.555，0.537，0.855，0.574,0.768，表達(dá)穩(wěn)定度由高到低排序依次為RPS18＞α-TUB＞RPL13a＞5.8srRNA＞β-actin＞GAPDH。再通過NormFinder軟件計(jì)算各內(nèi)參基因的穩(wěn)定度值，最終確定了在不同品系朱砂葉螨中以5.8s rRNA和RPS18兩個(gè)看家基因作為內(nèi)

6、參基因最理想，在不同螨態(tài)中以RPS18，α-TUB兩個(gè)看家基因作為內(nèi)參基因最理想，并據(jù)此建立了基于SYBR GreenⅠ染料技術(shù)的適于朱砂葉螨mRNA表達(dá)定量檢測(cè)的real-time PCR方法，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qrtPCR)。
　　 ⑵采用建立的qrtPCR方法檢測(cè)了酯酶基因TCE1和TCE2的mRNA在朱砂葉螨敏感品系的卵、幼螨、若螨和成螨四個(gè)螨態(tài)的相對(duì)表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果表明朱砂葉螨TCE2基因的表達(dá)量在各螨態(tài)中均顯著高于

7、TCE1基因(幼螨除外)，而兩條酯酶基因(TCE1和TCE2)mRNA的表達(dá)量均在成螨體內(nèi)最高。
　　 ⑶相對(duì)于敏感品系，TCE1基因在朱砂葉螨抗性品系(阿維菌素、甲氰菊酯和氧化樂果抗性品系)中的相對(duì)表達(dá)量為1.06～1.14倍，無顯著性差異；TCE2基因的相對(duì)表達(dá)量為1.39～2.47倍，均顯著高于在敏感品系中的表達(dá)。
　　 ⑷分別用亞致死劑量(LC30)的阿維菌素、氧化樂果和甲氰菊酯對(duì)朱砂葉螨敏感品系進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定誘

8、導(dǎo)前后酯酶基因TCE1和TCE2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，經(jīng)藥劑處理后，酯酶基因TCE1的表達(dá)量在處理后4h顯著下降，而后又上升，但其表達(dá)量在測(cè)定時(shí)間內(nèi)(處理后0-20h)一直沒有超過未施藥的對(duì)照。酯酶基因TCE2的表達(dá)量隨時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)，且與對(duì)照相比差異顯著。TCE2基因的相對(duì)表達(dá)量在受到三種藥劑誘導(dǎo)后的最高表達(dá)量分別是對(duì)照的1.64-，2.92-和2.24倍。以上研究表明朱砂葉螨酯酶基因TCE2擴(kuò)增是其對(duì)