鴨腸炎病毒UL45基因去跨膜區(qū)原核表達(dá)、抗體制備、轉(zhuǎn)錄時(shí)相及編碼蛋白特性研究.pdf

1、論文對(duì)新鑒定鴨腸炎病毒UL45基因(GenBank登錄號(hào)EU195107)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，原核表達(dá)并制備了UL45基因去跨膜區(qū)(UL45基因的295-675bp，命名為UL45Δ)蛋白的多克隆抗體，利用該抗體對(duì)UL45部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，主要內(nèi)容可歸納如下：
　　 1. DEV UL45基因的分子特性分析DEV UL45基因大小為675bp，編碼224aa,等電點(diǎn)為6.51。UL45蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，有一個(gè)較大的跨膜區(qū)

2、，閾值為0.5時(shí)共有13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括色氨酸(Serine)8個(gè)，蘇氨酸(Threonine)4個(gè)，酪氨酸(Tyrosine)1個(gè)。推測(cè)可能的B細(xì)胞表面抗原位于13～17,20～28,40～47,51～56,157～161和202～206位氨基酸，主要的T細(xì)胞表面抗原位于68～73,130～133和157～160位氨基酸。序列比對(duì)分析表明DEV CHv UL45與禽皰疹病毒氨基酸同源性較其他皰疹病毒高。密碼子偏嗜性分析表明UL

3、45基因偏嗜性不強(qiáng)，異源表達(dá)量較低，最適合于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
　　 2. DEV UL45去跨膜區(qū)的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備成功構(gòu)建了UL45全基因和去跨膜區(qū)的重組原核表達(dá)質(zhì)粒(pET-32-UL45和pET-32-UL45Δ)，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)PlysS菌中。IPTG誘導(dǎo)結(jié)果表明UL45全基因不能有效表達(dá)，去跨膜區(qū)的UL45Δ基因高效表達(dá)，得到大小約為33kDa的可溶蛋白，與預(yù)期蛋白大小一致。優(yōu)化的最

4、佳表達(dá)條件為0.2mmol/L IPTG,30℃誘導(dǎo)4h。重組蛋白純化后用于制備兔抗UL45Δ抗體，瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)表明其效價(jià)為1:32，免疫印跡結(jié)果表明抗體能特異性的識(shí)別UL45Δ蛋白，并且證明UL45基因是DEV基因組的組成部分。
　　 3. DEV UL45基因轉(zhuǎn)錄特性研究本研究用熒光定量PCR方法對(duì)DEV感染宿主細(xì)胞后病毒UL45基因mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果表明，感染后0～18h, UL45基因處于低轉(zhuǎn)錄

5、水平，24h后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量迅速增加，到42h達(dá)到高峰后有所下降，并一直持續(xù)到感染后72h。推測(cè)DEV UL45基因?qū)儆谕砥诨颉?br>　　 4. UL45基因編碼蛋白屬性分析利用超速離心機(jī)得到純化的DEV，并用去垢劑NP-40萃取純化病毒，破碎病毒結(jié)構(gòu)，得到上清(囊膜蛋白和極少數(shù)皮層蛋白)和沉淀(大多數(shù)皮層蛋白和衣殼蛋白)。通過(guò)對(duì)純化病毒和得到的上清、沉淀進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明UL45蛋白存在于純化病毒和上清中。推測(cè)UL45蛋白是