沙棘木蠹蛾白僵菌高毒菌株篩選和幾丁質酶基因克隆及其微膠囊制劑的研究.pdf

1、沙棘（Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi）是我國黃土丘陵區(qū)生態(tài)建設、經濟樹種之一，在內蒙古、遼寧等地分布面積廣。沙棘木蠹蛾（Holcocerus hippophaecolus Hua，Chou，F(xiàn)ang et Chen）鉆蛀危害沙棘干和根部，造成沙棘大面積死亡。球孢白僵菌(Beauveria. bassiana)侵染沙棘木蠹蛾幼蟲和蛹，導致其死亡。為更好利用白僵菌防治沙棘木蠹蛾，本

2、文從菌株篩選、酶活性、幾丁質酶基因克隆、分生孢子萌發(fā)促進劑、微膠囊研制及其生物測定等方面對寄生于沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌進行了比較系統(tǒng)的研究，主要內容包括：
　　1.白僵菌菌株篩選：從病死沙棘木蠹蛾幼蟲和蛹中分離純化得到5株球孢白僵菌菌株。室內通過比較生長速度、產孢量、萌發(fā)速度、不同溫、濕度下的分生孢子萌發(fā)率、對高溫的耐性、抗紫外線照射等方面篩選優(yōu)良菌株。結果表明，SJ-05菌株的各項生長指標較優(yōu)秀。SJ-05在76％的濕度下萌發(fā)率

3、為60％，是SJ-03的2.5倍。50℃高溫脅迫18 min，SJ-05的萌發(fā)率為48.77%，是SJ-03的2.5倍。紫外線持續(xù)照射8 h，SJ-05萌發(fā)率最高為33.92%是SJ-02的2.0倍。表明SJ-05菌株抗低濕能力、耐熱性和抗紫外照射能力強，為優(yōu)良菌株。
　　2.白僵菌菌株酶活性及幾丁質酶基因克隆：采用平板測定法和Lowry及DNS測定法對白僵菌菌株胞外蛋白酶和幾丁質酶活性進行測定。優(yōu)良菌株SJ-05胞外蛋白酶產量為

4、55.3 U/mL，幾丁質酶產量為137.9 U/mL，分別是菌株SJ-01的3.5倍和4.3倍?？寺〉玫角蜴甙捉┚鷰锥≠|酶基因，其核苷酸序列閱讀框架全長1047 bp，編碼348個氨基酸。推測其分子量為36.9 KDa，等電點為5.94，可能是從球孢白僵菌中克隆的一新幾丁質酶基因。
　　3.營養(yǎng)液、酸堿度、繼代培養(yǎng)及促進劑對 SJ-05孢子萌發(fā)的影響：1%蛋白胨、1%蔗糖和1%蠶蛹表皮3種營養(yǎng)液都可促進孢子萌發(fā)。孢子萌發(fā)最適pH

5、值為6.0～7.0。培養(yǎng)第5代后，SJ-05分生孢子的萌發(fā)率、萌發(fā)速度均明顯下降，培養(yǎng)16h時，第3代的萌發(fā)率為97%，第4代的萌發(fā)率為87%，第5代的萌發(fā)率僅為40%。AA、BB兩種促進劑對白僵菌分生孢子的萌發(fā)有明顯促進作用，并隨濃度的增大對孢子萌發(fā)的促進作用均有不同程度的增強，培養(yǎng)14 h和18 h時，1.5 ppm AA、BB兩種促進劑中孢子萌發(fā)率高，分別為46%和96%，分別是對照組的2.6倍和2.5倍。促進劑CC對分生孢子萌發(fā)

6、率的促進作用不明顯，高濃度時有一定抑制作用。
　　4.微膠囊的研制與性能測定：用界面聚合法對SJ-05分生孢子制備微膠囊，通過4因素4水平正交試驗，C含量100%、E含量0.5%、F濃度0.5 M、轉速500 r/min是制備微膠囊的最優(yōu)組合。在61%濕度下，SJ-05微膠囊孢子萌發(fā)率為33.85%，分生孢子菌懸液不萌發(fā)。微膠囊與分生孢子懸液經30W、40cm處紫外線照射后的孢子萌發(fā)率均下降，但是微膠囊有一定的抗紫外能力。紫外照射

7、10 h，微膠囊孢子萌發(fā)率26.91%，分生孢子懸液孢子萌發(fā)率僅3.92%。
　　5.生物測定：室內模擬野外條件，SJ-05分生孢子及微膠囊對沙棘木蠹蛾幼蟲的的致死率分別為45.54%和84.54%，說明SJ-05微膠囊對沙棘木蠹蛾幼蟲的侵染明顯高于其分生孢子。同時，室內測定SJ-05對枸杞負泥蟲幼蟲、落葉松毛蟲幼蟲及沙棘木蠹蛾幼蟲的侵染，SJ-05分生孢子對三種害蟲幼蟲的LC50分別為3.45×107個孢子/mL、2.92×10