水稻T-DNA插入突變體庫的構建及控制水稻株高和花粉育性基因OsLIS-L1的分離與鑒定.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半人口以其為主食，同時，水稻也被視為單子葉植物研究的模式植物。隨著人類對包括水稻在內的多種植物基因組測序的完成，現(xiàn)在的生物研究已進入到功能基因組時代，構建水稻大型T-DNA插入突變體庫是在全基因組水平上研究基因功能的重要技術平臺。本研究參與構建了水稻T-DNA插入突變體庫，創(chuàng)建了約60，000株獨立轉化子。
　　 株高是水稻的重要農藝性狀之一，它與植株的豐產潛力，抗倒伏和肥料的耐久性密切相

2、關。20世紀60年代以矮化育種為標志的“綠色革命”，使水稻產量有了前所未有的突破。自此以后，株高的遺傳基礎得到了廣泛研究。植物花藥的發(fā)育是一個非常復雜的過程，包括了從花藥囊壁的發(fā)育、花粉母細胞的發(fā)育，到小孢子的產生、花粉粒的成熟，其中只要任何一個步驟出現(xiàn)不正常，最終都有可能影響整個植株的育性。此過程涉及諸多基因，研究這些基因在花藥發(fā)育過程中生理生化方面的功能，將有利于對花藥發(fā)育取得更深入的認識，具有非常大的理論和實際應用價值。本研究利用

3、本室水稻T-DNA插入突變體庫篩選了3.905個突變家系，得到134份初步共分離的突變家系和1個共分離家系，并分離鑒定了一個控制水稻株高和花粉育性的新基因OsLIS-L1，主要研究結果如下：
　　 1.創(chuàng)建獨立T-DNA轉化單株約60，000株。
　　 2.篩選3，905個突變家系，得到134份初步共分離的突變家系和1個共分離家系：03Z11AI23(本室陳志輝提供的初篩材料)。將03Z11AI23家系分離出的半矮和低育

4、性突變體命名為oslis-l1-1，且對oslis-l1-1進行詳細的突變表型分析并分離克隆相應基因OsLIS-L1。03Z11AI23家系的T1代及其T2代共分離檢測顯示：半矮和低育性的突變性狀與T-DNA純合插入完全共分離。
　　 3.從韓國POSTECH大學的突變體庫中得到等位突變體：3A-04974，命名為oslis-l1-2，突變性狀也是半矮和低育性，共分離檢測也是完全共分離。
　　 4.通過RNAi干涉技術抑

5、制野生型材料中內源OsLIS-L1基因的表達，導致水稻的株高和育性顯著降低；而將OsLIS-L1轉入oslis-11-2突變體后，可以使株高和育性恢復，這充分證明了OsLIS-L1基因是控制水稻株高和花粉育性的基因。
　　 5.RT-PCR分析顯示：在兩個等位突變體中，由于T-DNA的插入產生2個不同的截斷的轉錄本。
　　 6.花粉母細胞壓片染色觀察突變體的減數(shù)分裂過程，結果顯示：oslis-l1-2突變體和野生型在整個

6、減數(shù)分裂過程中沒有明顯的差異，說明低育性與花粉減數(shù)分裂過程無關。
　　 7.KI-I2溶液染色成熟花粉顯示：突變體的花粉粒幾乎全不著色，這表明突變體雄性不育。而用oslis-l1-2突變體花粉做母本，野生型花粉做父本，則雜交結實正常，表明突變體雌性育性基本正常。
　　 8.野生型和oslis-l1-2突變體花藥半薄切片結果顯示：相較于野生型花藥的發(fā)育，oslis-l1-2突變體花粉囊壁的發(fā)育正常，花粉母細胞及其隨后的小孢

7、子的發(fā)育也沒有明顯變化，但從花藥發(fā)育第十期(stage10)至成熟花粉時期，花粉粒皺褶、干癟，沒有活力。說明目的基因OsLIS-L1的失活產生大量不正常的花粉，導致低育性表型出現(xiàn)。花藥透射電鏡(TEM)結果與花藥半薄切片結果一致，oslis-l1-2花藥囊壁的發(fā)育沒有受到影響，中間層和絨氈層細胞可以正常降解；并且花粉壁的發(fā)育也沒有受到影響。
　　 9.對野生型和oslis-l1-2突變體成熟期莖的不同節(jié)間長度進行考察，發(fā)現(xiàn)除了第

8、一節(jié)間長度有明顯差距外，其它節(jié)間長度均無明顯差距，然后采用半薄切片的方法來觀察野生型和oslis-l1-2突變體莖第一節(jié)間的細胞形態(tài)。半薄切片結果顯示：野生型和oslis-l1-2突變體莖第一節(jié)間的細胞層數(shù)和大小均無明顯差別，說明目的基因OsLIS-L1的失活引起莖第一節(jié)間細胞數(shù)目的減少，導致株高變矮。
　　 10.實時定量PCR分析顯示：抽穗期時OsLIS-L1基因在根、莖、葉、葉鞘和穗中都有不同程度的表達，但在莖和穗中表達量