雞毒支原體JN株的分離鑒定及PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum，MG)是雞的慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease，CRD)的病原體，其特征為呼吸啰音、咳嗽、流漿液性鼻液，氣囊炎，嚴重時張口呼吸。通常與病毒、細菌協(xié)同感染，導致呼吸道癥狀加劇，使死亡率增高。MG感染在國內(nèi)禽群中相當普遍，感染后雞死亡率一般很低，主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率、孵化率降低，出欄期延長和飼料利用率降低，對該病的預防和控制程序也額外增加了成本，同時

2、造成禽產(chǎn)品中藥物殘留，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
　　 本研究通過對山東濟南某雞場(舍)的患呼吸道疾病的雞進行支原體的分離，通過菌落觀察及細菌L型恢復試驗，分離純化了一個支原體分離物。對所分離的支原體分離物進行了菌落形態(tài)觀察、菌落紅細胞吸附試驗、生理生化及血清學鑒定，結(jié)果該分離物被鑒定為雞毒支原體，命名為JN株。JN株在不含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，加入四氮唑能使培養(yǎng)基顏色變橙紅色，在固體培養(yǎng)基表面所形成的菌落呈典型的油煎蛋狀外觀

3、，大小約0.1～0.4mm，抗MG血清對JN株的代謝有抑制作用。
　　 通過JN株在不同血清培養(yǎng)基的生長情況，可以看出該菌株易于在豬血清培養(yǎng)基中生長，可以代替價格較貴且來源有限的馬血清。從MG對雞氣管環(huán)的致病性試驗結(jié)果可看出JN菌株對氣管環(huán)纖毛的損傷較大，能夠引起雞胚氣管環(huán)纖毛運動快速停止，致病力較F疫苗株強。同時，SDS-PAGE電泳圖譜顯示JN株、F株之間的蛋白條帶有一定差異，可以說明JN株的致病性與結(jié)構(gòu)蛋白之間存在一定的相

4、關性。
　　 針對雞毒支原體(MG)、雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)和火雞支原體(Mycoplasma meleagridis，MM)設計了3對引物，大小分別為MG 732bp，MS 208bp，MM 850bp，通過單一PCR反應，分別得到了相應的目的片段，并且建立的多重PCR反應優(yōu)化后，可同時得到3條目的條帶，與單一PCR擴增結(jié)果一致。實驗表明，由此建立的多重PCR方法可用于MG、MS和MM的

5、同時檢測和鑒別診斷，且簡便快捷，靈敏度高，特異性強。
　　 針對雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、雞新城疫病毒(NDV)和雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)等4種主要呼吸道傳染病病原設計了4對特異性引物，大小分別為：IBV 1720bp、AIV 550bp、NDV 300bp、ILTV 647bp，與MG、MS建立多重RT-PCR，反應優(yōu)化后可同時擴增出了清晰的目的條帶。實驗表明，建立的多重RT-PCR可用于混

6、合感染上述6種呼吸道傳染病病原的鑒別診斷。
　　 通過藥物浸泡法、溫差法和熏蒸法分別處理支原體污染嚴重的種蛋，出雛8周后對支原體抗體陽性率進行檢測，結(jié)果為：百毒殺處理組13％，紅霉素處理組17％，溫差法處理組9％，熏蒸法處理組18％，而未經(jīng)處理的MG陽性種蛋支原體陽性檢出率卻高達86.4％，盡管孵化率有不同程度的下降，但都能夠顯著降低MG的垂直傳播。通過對孵化率、MG抗體檢出率和35日齡平均體重、110日齡平均體重等指標進行綜合