環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)燦爛弧菌的研究.pdf

1、燦爛弧菌（Vibrio splendidus）是養(yǎng)殖刺參的主要致病菌之一，可引起刺參腐皮綜合癥，死亡率高達(dá)90％，還可引起養(yǎng)殖牙鲆、大菱鲆、鱒魚、大西洋鮭、鱸魚等的多種疾病。目前針對(duì)燦爛弧菌的檢測(cè)方法包括基于細(xì)菌培養(yǎng)的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)（涂布平板法，生理生化指標(biāo)鑒定等），基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法（玻片凝集法，雙抗夾心ELISA，Dot-ELISA，間接熒光檢測(cè)等）和基于DNA檢測(cè)的分子生物學(xué)方法（PCR法，核酸探針雜交等）。這些方法具有步

2、驟繁瑣、所需設(shè)備昂貴、耗時(shí)長、對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高等特點(diǎn)，一定程度上限制了其在海水養(yǎng)殖基層的應(yīng)用推廣。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是2000年由Notomi開發(fā)出的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。其利用特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件下進(jìn)行基因高效擴(kuò)增，具有操作簡單、成本低廉、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，已在許多人類疾病的檢測(cè)和診斷中應(yīng)用

3、。利用LAMP技術(shù)，建立、完善一種快速高效、簡便易行的燦爛弧菌檢測(cè)方法，進(jìn)行燦爛弧菌病的預(yù)防和現(xiàn)場快速診斷，減少、減輕因燦爛弧菌感染所造成的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
　　本研究通過生物信息學(xué)分析，參照弧菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)和GenBank中燦爛弧菌的基因組信息，篩選用于LAMP引物設(shè)計(jì)的燦爛弧菌中潛在的毒力相關(guān)基因，通過蛋白保守區(qū)域分析和基因同源比對(duì)，利用在線引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)引物并合成。結(jié)

4、合實(shí)驗(yàn)分析，選定燦爛弧菌鞭毛相關(guān)基因flgF進(jìn)行條件優(yōu)化，檢測(cè)了LAMP反應(yīng)體系中dNTP、Betaine、Mg2+濃度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP的影響，優(yōu)化并確定了最佳反應(yīng)條件。以PCR為對(duì)照，分析了LAMP法檢測(cè)燦爛弧菌的特異性和靈敏度，并對(duì)比了幾種LAMP結(jié)果的肉眼分析方法。為開發(fā)基于LAMP技術(shù)的海水養(yǎng)殖中燦爛弧菌快速檢測(cè)試劑（盒）奠定基礎(chǔ)。
　　本研究獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、用于燦爛弧菌LAMP快速檢測(cè)的引物為:

5、
　　正向外引物F3:5'-GGATCGCGCACTGTTTCT-3'
　　反向外引物B3:5'-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3'
　　正向內(nèi)引物FIP:5'-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3'
　　反向內(nèi)引物BIP:5'-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3';
　　2、最佳反應(yīng)體系:F3

6、和B3，0.2μM; FIP和BIP，1.6μM; dNTP，1.0 mM;Betaine，0.1 M; Mg2+，5.0 mM;模板1μL; Bst DNA聚合酶緩沖液(10×)，2.5μL;BstDNA聚合酶（大片段）為8U，加水補(bǔ)至25μL。最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min～45 min。
　　3、特異性分析:對(duì)16株待測(cè)菌株培養(yǎng)物和DNA檢測(cè)中，燦爛弧菌的陽性檢出率為100％，與其他菌株未出現(xiàn)明顯的交叉反應(yīng)。
　　4、靈敏