鰱魚(yú)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、隨著我國(guó)漁業(yè)的發(fā)展,水產(chǎn)品產(chǎn)量持續(xù)增加,魚(yú)糜制品已成為淡水魚(yú)加工利用的一個(gè)主要方向。但是,魚(yú)糜制品生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的凝膠劣化現(xiàn)象嚴(yán)重影響制品質(zhì)量。本研究室已從多種魚(yú)類肌肉中提取到肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(Myofibril Bound Serine Protein,MBSP),且發(fā)現(xiàn)該酶能催化肌原纖維產(chǎn)生降解作用,推測(cè)其與凝膠裂化現(xiàn)象密切相關(guān)。該酶的抑制劑肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Myofibril Bound Serine P

2、rotein Inhibitor,MBSPI)現(xiàn)也已從多種魚(yú)類中得到分離純化,并證明其本質(zhì)是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI),該抑制劑能有效抑制MBSP對(duì)肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MHC)的降解作用。海水白姑魚(yú)的GPI對(duì)淡水鯉魚(yú)的MBSP無(wú)抑制作用,同樣淡水鯽魚(yú)的GPI也不能抑制白姑魚(yú)MBSP的活性,提示GPI對(duì)MBSP的抑制作用具有種屬特異性。
　

3、　本實(shí)驗(yàn)以鰱魚(yú)為研究對(duì)象,以GPI的保守位點(diǎn)堿基序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR方法并結(jié)合cDNA快速末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)得到了兩條編碼鰱魚(yú)GPI的基因序列,命名為GPIA、GPIB,GenBank登錄號(hào)分別為JF958124和JF907593,推導(dǎo)的氨基酸序列GenBank登錄號(hào)分別為AEI61932和AEH76920。
　　GPIA的cDNA全長(zhǎng)為2

4、008 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?662 bp,共編碼553個(gè)氨基酸,推導(dǎo)分子量為62.12 kDa,等電點(diǎn)為6.27。GPIB的cDNA全長(zhǎng)為2110 bp,開(kāi)放閱讀框也是1662bp,編碼553個(gè)氨基酸,推導(dǎo)分子量為62.22kDa,等電點(diǎn)為6.82。GPIA和GPIB氨基酸序列相似性為83％,序列中均含有異構(gòu)酶活性所必須的保守位點(diǎn),其中Ser-159、Ser-209、Lys-210、Thr-211、Thr-214、Glu-357、Val

5、-514、Leu-516直接與磷酸底物作用,Glu-216、Arg-272、His-388、Lys-518穩(wěn)定整個(gè)催化活性中心結(jié)構(gòu)。二者均不含信號(hào)肽,但均含有潛在的糖基化位點(diǎn)。
　　鰱魚(yú)GPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。用同源建模法分析鰱魚(yú)GPI三級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)鰱魚(yú)GPI單體含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,二者結(jié)構(gòu)相似,都含有一個(gè)β折疊構(gòu)成的中心,由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲包裹,α-20和α-21構(gòu)成一個(gè)鉤子結(jié)構(gòu),C末端形成臂結(jié)構(gòu),這兩

6、種結(jié)構(gòu)均有利于GPI與相鄰的單體形成二聚體。GPI二聚體由兩個(gè)亞基以非對(duì)稱的方式團(tuán)抱,各亞基延伸出的鉤子及臂結(jié)構(gòu)會(huì)環(huán)抱住另一亞基,這種“互相擁抱”的結(jié)構(gòu)增進(jìn)了GPI二聚體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
　　系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)硬骨魚(yú)中含有兩種GPI基因,其他脊椎動(dòng)物都只含有一種GPI基因,在硬骨魚(yú)中GPIA和GPIB又各自形成分支,因此可以認(rèn)為GPI的基因分化晚于四足動(dòng)物與鰭魚(yú)的分化,但早于硬骨魚(yú)的形成時(shí)期。
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示GPIA