柑橘全爪螨種群遺傳結構及全線粒體基因組序列分析.pdf

1、柑橘全爪螨(Panonychus cirri)隸屬蛛形綱(Arachnida)、蜱螨亞綱(Acari)、葉螨科(Tetranychidae),是一種世界性分布的柑橘害螨。在我國,該螨發(fā)生面積廣、種群密度高、為害時間長,是大多數柑橘種植區(qū)的關鍵害蟲(螨)之一。該螨能夠快速地對多種殺螨劑產生高水平抗性,增加了生產中對其有效防控的難度。目前,對該螨的研究很少涉及種群遺傳與進化,這很大程度上源于缺乏有效的分子遺傳標記以及單雌DNA提取的困難。深

2、入研究柑橘全爪螨不同地理種群的遺傳結構,有利于從分子水平上了解柑橘全爪螨的生態(tài)適應機制和成災規(guī)律,為制定有效的控制策略提供理論依據。近年來,葉螨對新型線粒體靶標殺螨劑聯苯肼酯等產生了嚴重抗性,據報道該類抗性源于線粒體cob基因的點突變。因此,測定柑橘全爪螨全線粒體基因組序列,不僅可以豐富蜱螨線粒體基因組數量,推動蜱螨及其它節(jié)肢動物動物分子系統學的研究,還可針對突變了的線粒體基因設計引物,進而建立快速、準確的田間抗性診斷技術。
　　

3、 本學位論文緊密圍繞柑橘全爪螨種群遺傳與進化這一重要科學問題,致力于發(fā)掘柑橘全爪螨的微衛(wèi)星位點,重點解析該螨的種群遺傳結構,測序獲得全線粒體基因組序列,分析葉螨線粒體基因組的進化特點,鑒定適于葉螨分子系統學研究的線粒體分子標記,并構建基于全線粒體基因組序列數據的蜱螨系統發(fā)生關系。主要研究結果如下:
　　 1.在提取、純化柑橘全爪螨基因組DNA的基礎上,采用磁珠富集法構建了柑橘全爪螨AC、TC和ATG等3個微衛(wèi)星富集文庫。對3個

4、富集文庫的部分陽性克隆進行測序,獲得了44個可進行引物設計的微衛(wèi)星位點。序列分析表明,柑橘全爪螨AC富集文庫的微衛(wèi)星位點大部分以多拷貝的形式存在,部分以微衛(wèi)星DNA家族的形式存在。因此,TC文庫和ATG文庫中發(fā)掘的微衛(wèi)星位點更適合作為分子標記研究該螨的種群遺傳結構。在富集文庫的構建過程中,筆者通過將酶切、接頭連接一步化,減少了酶切產物的損失,提高了酶切產物的量,有效地提高了微衛(wèi)星的富集效率。
　　 2.聯合線粒體cox1基因和核

5、糖體內轉錄間隔區(qū)ITS1序列,分析了15個柑橘全爪螨地理種群的遺傳多樣性、種群遺傳分化及基因交流模式,結果發(fā)現:(1)基于線粒體cox1基因的數據顯示,15個地理種群中共發(fā)現22個單倍型;基于核ITS1序列的數據,共發(fā)現134個單倍型。綜合兩種分子標記的結果推測,15個柑橘全爪螨地理種群具有相對較高的遺傳多樣性,這可能是該螨在各地能夠頻繁成災、對殺螨劑快速產生抗性的遺傳基礎;(2)系統發(fā)育樹和單倍型進化網絡圖顯示,來自同一種群或相同柑橘

6、種植區(qū)的柑橘全爪螨的cox1單倍型或ITS1單倍型,均未能聚集在一起。AMOVA分析表明,柑橘全爪螨在本論文所涉及的長江中上游(UMYR)、云貴高原(YGP)和華南(SC)等3個柑橘種植區(qū)間無顯著的種群遺傳結構。如果分析時去除云南玉溪和湖北丹江口種群時,僅基于線粒體cox1基因數據的AMOVA分析發(fā)現,柑橘全爪螨在3個柑橘種植區(qū)間存在顯著的種群遺傳結構。僅基于核ITS1序列數據的AMOVA分析表明,當來自長江中上游柑橘種植區(qū)(UMYR)

7、和云貴高原柑橘種植區(qū)(YGP)的種群作為一個組群時,柑橘全爪螨存在顯著的種群遺傳結構。此外,基于核ITS1序列數據的AMOVA分析還發(fā)現,寄主植物對柑橘全爪螨種群遺傳結構具有顯著影響。總體上看,柑橘全爪螨大多數種群間遺傳分化不顯著,這可能是因為受到部分種群之間存在高水平的基因流、保留有較大的祖先多態(tài)性以及自然選擇(如寄主植物、殺螨劑等)等多個因素的共同影響;(3)盡管大多數種群間遺傳分化不顯著,特別是一些地理上相距很遠的種群間還存在高水

8、平的基因流(如眉山和廣東種群間),但基于兩種分子標記的Mantel檢驗結果均表明,地理隔離仍然是柑橘全爪螨種群遺傳分化的重要原因之一。柑橘全爪螨體小、無翅,主動遷移能力非常有限。因此,柑橘全爪螨的長距離遷移和種群間的基因交流,很大程度上依賴于柑橘種苗的運輸等人類活動;(4)基于兩種分子標記的中性檢驗、誤配分析及星狀分布的單倍型進化網絡圖均支持,柑橘全爪螨在歷史上經歷了種群擴張事件;(5)基于上述研究結果及柑橘全爪螨快速發(fā)展的抗藥性問題,

9、在制定該螨的控制策略時,對于抗性基因在不同種群間的擴散及進化應予高度重視。
　　 3.采用Long-PCR和Sub-PCR技術,克服了葉螨線粒體基因序列高A+T含量及基因高度重排等因素造成的PCR擴增、測序困難等問題,成功測定了柑橘全爪螨全線粒體基因組序列。柑橘全爪螨全線粒體基因組具有以下特點:(1)柑橘全爪螨線粒體基因組在目前已測序的節(jié)肢動物中最小,但并不缺失經典后生動物線粒體基因組所包含的37個基因;(2)與節(jié)肢動物線粒體基

10、因的模式排序(鱟的線粒體基因排序)相比,柑橘全爪螨線粒體基因組發(fā)生了一系列的重排事件,其中2個蛋白質編碼基因區(qū)塊的倒位最為顯著,此外,24個RNA基因也高度重排;(3)柑橘全爪螨線粒體最大的非編碼區(qū)長度僅為57bp,完全由堿基A和T組成,且可形成穩(wěn)定的莖環(huán)二級結構,推測該非編碼區(qū)是線粒體控制區(qū);(4)柑橘全爪螨線粒體基因組具有極高的A+T含量,在已測序的蜱螨線粒體基因中僅略低于蘋果全爪螨。這種高的A+T含量,也反應在蛋白質編碼基因的密碼

11、子使用上,即以A或T結尾的密碼子,占絕對優(yōu)勢。在62種無脊椎動物線粒體密碼子中,柑橘全爪螨線粒體基因組僅使用了其中的57個密碼子,而未使用5個富含GC的密碼子。此外,與大多數后生動物相反,柑橘全爪螨線粒體基因組J-鏈的GC-偏斜為正值;(5)柑橘全爪螨線粒體基因組中僅3個tRNA基因(trnN、trnL2和trnK)能形成經典的三葉草結構,而其余19個tRNA基因均缺少D-臂或T-臂;trnI的反密碼子環(huán)為非典型的8個核苷酸,trnM和

12、trnS1在反密碼子莖上各有1個堿基錯配,13個tRNA基因在氨基酸接受臂上存在1至3個不等的堿基錯配;(6)柑橘全爪螨線粒體基因組2個rRNA基因發(fā)生倒位而由J-鏈編碼,rrnL和rrnS長度的顯著減小導致其丟失了多個螺旋結構,但與蒼白纖恙螨(Leptotrombidiumpallidum)和戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)具有相似的莖環(huán)二級結構。
　　 4.以全爪螨屬的柑橘全爪螨(包括2

13、個地理種群)、蘋果全爪螨和葉螨屬的二斑葉螨、神澤葉螨為對象,采用比較基因組學和生物信息學的研究手段,從科內、屬內和種內等三個層次,系統分析了葉螨線粒體基因組的分子進化特征及其遺傳分化水平。結果表明:(1)4種葉螨線粒體基因組在已測節(jié)肢動物中最小,但均包含經典后生動物線粒體基因組所具有的37個基因。與其它蜱螨和節(jié)肢動物相比,葉螨線粒體基因組的相對減小,主要體現在蛋白質編碼基因、rrnL和控制區(qū)的長度都顯著縮短;(2)4種葉螨線粒體基因排序

14、完全一致,具有極高的A+T含量,蛋白質編碼基因存在強烈的密碼子使用偏向性,但全爪螨屬物種未使用的富含GC的密碼子數量略高于葉螨屬物種;(3)全爪螨屬物種J-鏈的GC-偏斜為正值,A+T富集區(qū)的二級結構具有2個莖環(huán)結構,而葉螨屬J-鏈的GC-偏斜為負值,A+T富集區(qū)的二級結構僅有1個莖環(huán)結構;(4)4種葉螨線粒體基因組中的tRNA基因極不典型,19個tRNA基因均缺少D-臂或T-臂,有的tRNA基因甚至同時缺少D-臂和T-臂。此外,部分t

15、RNA基因與鄰近基因高度重疊,部分tRNA基因在氨基酸接受臂或反密碼子莖上存在堿基錯配,而trnI的反密碼子環(huán)均為非典型的8個核苷酸。但是,葉螨的這些不典型tRNA基因不可能是假基因,因為22個tRNA基因序列在4種葉螨中高度保守,特別是反密碼子臂;氨基酸接受臂上或反密碼子莖上的堿基錯配可通過轉錄后的RNA編輯而得以校正;在線蟲中已證實,缺少T-臂的tRNA基因具有正常的生物學功能;不典型的tRNA基因在真螨總目中非常普遍。然而,由于對

16、同時缺少D-臂和T-臂的tRNA基因是否具有正常的生物學功能還未知,因此有必要進一步開展功能性驗證實驗;(5)4種葉螨線粒體基因組的rRNA基因具有相似的二級結構,但柑橘全爪螨的rrnL有其余3種葉螨均缺少的H3螺旋結構。與5'-端相比,rrnL的3'-端在4種葉螨線粒體基因組中更為保守,特別是螺旋結構G16-G20,而rrnS二級結構中的19、21、32、33、49和50等6個螺旋結構最為保守;(6)基于全線粒體基因組序列、13個蛋白

17、質編碼基因序列、24個RNA基因序列的分析表明,4種葉螨屬間的遺傳分化程度遠大于屬內和種內。二斑葉螨和神澤葉螨之間的P-距離小于蘋果全爪螨和柑橘全爪螨間的P-距離,但遠高于柑橘全爪螨兩個品系間的P-距離;(7)葉螨線粒體基因組的13個蛋白質編碼基因中,僅3個基因(cob、cox3和had1)的密碼子數在4種葉螨中完全一致,其余10個基因的密碼子數均不相同。序列進化分析表明,cox1、cox2和cob最為保守,表明適于葉螨較高分類階元的系

18、統發(fā)生關系研究:而atp8、nad2、had6和nad4L等4個基因的遺傳分化較高,適于作為分子標記來研究葉螨種內的遺傳多樣性或界定近緣物種間的系統親緣關系。
　　 5.基于已測序的28種蜱螨線粒體全基因組序列數據,在系統評價堿基組成異質性的基礎上,采用最大似然法(ML)和貝葉斯推斷法(BI)構建了蜱螨亞綱內各類群的系統發(fā)生關系。盡管28種蜱螨線粒體基因組序列存在顯著的堿基組成異質性,但基于PCG123、PCG12和PCG2等3

19、個數據集構建的ML樹和BI樹,以及基于PCG-RNA和PCG1等2個數據集構建的ML樹,均很好地反應出目前普遍接受的蜱螨亞綱內各類群的系統發(fā)育關系,支持蜱螨亞綱中寄螨總目和真螨總目均為單系群的觀點。寄螨總目的蜱目和中氣門目均為單系群,蜱目由硬蜱和軟蜱兩個互為姊妹群關系的單系群構成,而中氣門目中的植綏螨總科與皮刺螨總科互為姊妹群,兩者再與胭螨總科構成姊妹群關系。真螨總目由絨螨目和疥螨目兩個互為姊妹群的單系群組成;絨螨目的游殖螨亞目和寄殖螨