仿刺參(Apostichopus japonicus)微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、仿刺參(Apostichopus japonicus)又名刺參,主要分布于我國(guó)北方、日本、朝鮮半島及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū),由于具有較高的食用和養(yǎng)生保健價(jià)值,迅速成為我國(guó)海水養(yǎng)殖的重要品種。培養(yǎng)抗逆性高、生長(zhǎng)速度快的新品種是保持刺參養(yǎng)殖業(yè)健康與可持續(xù)性發(fā)展的有效途徑,而飛速發(fā)展的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)為優(yōu)良品種的快速培育提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本研究以仿刺參為主要研究材料,探討了仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記的有效篩選方法及微衛(wèi)星標(biāo)記在仿刺參標(biāo)記輔助育種中

2、的應(yīng)用。
　　 1.仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和評(píng)價(jià)
　　 本研究利用EST文庫(kù)篩查法和富集文庫(kù).菌落原位雜交法篩選得到了仿刺參的多個(gè)微衛(wèi)星序列。利用至少48個(gè)仿刺參個(gè)體對(duì)全部位點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果共獲得了276個(gè)多態(tài)性良好的微衛(wèi)星標(biāo)記。其中通過EST文庫(kù)篩查法獲得了59個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn),不同的位點(diǎn)獲得的等位基因數(shù)為2～10個(gè)不等,平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增得到4.8個(gè)等位基因,觀測(cè)雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.000～0.900

3、和0.202～0.890;通過富集文庫(kù)—菌落原位雜交法獲得了217個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),全部位點(diǎn)獲得的等位基因數(shù)目范圍為2～15個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增得到6.8個(gè)等位基因,觀測(cè)雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.000～1.000和0.180～0.948。這些微衛(wèi)星標(biāo)記將成為仿刺參群體遺傳學(xué)研究、微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位和分子標(biāo)記輔助選育等工作的有力工具。
　　 2.全基因組擴(kuò)增技術(shù)在仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記分型中的應(yīng)用

4、　　 在基因型的檢測(cè)過程中,仿刺參幼蟲由于個(gè)體大小的限制而無法為大量位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增提供足量的模板。為了解決這一問題,本實(shí)驗(yàn)采用MDA全基因組擴(kuò)增技術(shù)對(duì)仿刺參耳狀幼蟲進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增,并評(píng)價(jià)了此方法的擴(kuò)增效率和保真性,為通過MDA方法從仿刺參幼蟲中獲得大量DNA以滿足分子標(biāo)記分析的需要做好了技術(shù)準(zhǔn)備。選用了仿刺參一個(gè)F1代全同胞家系的2個(gè)親本和30個(gè)處于大耳期的幼蟲為實(shí)驗(yàn)材料,使用QIAGEN Repli-g UltraFast M

5、ini Kit全基因組擴(kuò)增試劑盒對(duì)子代幼蟲進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示,得到的基因組DNA片段較為完整,每次反應(yīng)可以獲得的DNA總量在1000ng左右。以這些DNA為模板,隨機(jī)擴(kuò)增了50對(duì)微衛(wèi)星引物,獲得了1500個(gè)基因型。與親本基因型進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果顯示,在1500個(gè)基因型中有7個(gè)基因型出現(xiàn)了錯(cuò)誤,占全部基因型數(shù)目的0.47％。在錯(cuò)誤的基因型中,有4個(gè)為等位基因增加、2個(gè)為等位基因丟失、1個(gè)為等位基因片段長(zhǎng)度

6、錯(cuò)誤。本研究的結(jié)果表明,通過MDA技術(shù)對(duì)仿刺參幼蟲進(jìn)行擴(kuò)增,可以得到優(yōu)質(zhì)、足量的DNA,這些DNA能夠進(jìn)一步的應(yīng)用于微衛(wèi)星標(biāo)記的分析中。
　　 3.微衛(wèi)星標(biāo)記在仿刺參家系鑒定中的應(yīng)用
　　 本研究使用多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,在仿刺參(9♀)×(1♂)、(10♀)×(10♂)兩個(gè)關(guān)聯(lián)家系中,對(duì)標(biāo)記的親子鑒定能力和親子鑒定的準(zhǔn)確率進(jìn)行了研究。首先選擇12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),對(duì)這兩個(gè)家系的30個(gè)親本在每個(gè)位點(diǎn)上的基因型進(jìn)行了分析,將所獲得的

7、分型結(jié)果使用軟件Cervus3.0進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬分析。模擬分析的結(jié)果顯示,在子代兩個(gè)親本基因型都未知的情況下,全部12個(gè)位點(diǎn)的累計(jì)排除率(Exc11)為99.824％;在已知一個(gè)親本基因型的情況下,全部12個(gè)位點(diǎn)的累計(jì)排除率(Exc12)為99.996％。在單位點(diǎn)排除率最高的7個(gè)位點(diǎn)組合時(shí),Exc11和Exc12分別為99.016％和99.912％。在單獨(dú)養(yǎng)殖的(9♀)×(1♂)家系中對(duì)這7個(gè)位點(diǎn)組合的準(zhǔn)確率進(jìn)行檢驗(yàn),鑒定結(jié)果與養(yǎng)殖記

8、錄比對(duì)顯示,270個(gè)子代在父本已知、有9個(gè)候選母本的情況下,有264個(gè)子代個(gè)體找到了正確的母本,鑒定率為97.78％。在將這些微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于(10♀)×(10♂)混養(yǎng)家系時(shí),在40個(gè)可能的親本、500個(gè)子代個(gè)體中,93.8％的子代可以鑒定其父母本。本研究建立了一套適用于仿刺參的微衛(wèi)星標(biāo)記親子鑒定體系,對(duì)選育中保持家系信息、確定親緣關(guān)系、追蹤家系提供了有力工具,為仿刺參的育種規(guī)劃奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 4.仿刺參微衛(wèi)星連鎖圖譜的

9、構(gòu)建及生長(zhǎng)相關(guān)性狀QTLs定位的初步研究
　　 為了加強(qiáng)仿刺參選育工作的有效性和準(zhǔn)確性,真正在仿刺參中實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選育,本文利用1個(gè)(9♀)×(1♂)的關(guān)聯(lián)家系的F1子代和509個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了仿刺參的雄性遺傳連鎖圖譜。全部位點(diǎn)中共有298個(gè)可以用于父本作圖,最終共193個(gè)標(biāo)記被定位到框架圖譜上,形成22個(gè)連鎖群,圖譜總長(zhǎng)度為1905cM,標(biāo)記的平均間隔為10.0cM。每個(gè)連鎖群的長(zhǎng)度在36.9cM和182.4cM之間,平