馬立克氏病患雞中錯(cuò)配修復(fù)基因PMS1的初步研究.pdf

1、雞馬立克氏病是雞的一種由馬立克氏病毒引起的以淋巴組織增生為特點(diǎn)的腫瘤性疾病。此病是世界上第一個(gè)能用疫苗預(yù)防的腫瘤病，長期以來人們一直對(duì)病原，組織病理學(xué)和早期分子生物學(xué)診斷進(jìn)行深入的研究。盡管馬立克氏病長期以來是科研工作的熱點(diǎn)，但馬立克腫瘤的發(fā)生機(jī)理尚未闡明。人類大量研究表明，遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌、大腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌等的發(fā)生均與錯(cuò)配修復(fù)基因有關(guān)。普遍認(rèn)為，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能的降低或缺失與癌前微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及癌癥的發(fā)生

2、有關(guān)。本試驗(yàn)初步探索雞發(fā)生馬立克腫瘤后錯(cuò)配修復(fù)基因PMS1在DNA及mRNA水平上的變化情況，旨在發(fā)現(xiàn)發(fā)病后PMS1是否出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及表達(dá)異常。
　　 試驗(yàn)一，利用軟件SSRHunter尋找PMS1中的微衛(wèi)星位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心序列及側(cè)翼序列。提取22只馬立克發(fā)病雞的正常及腫瘤組織的DNA，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的片段，經(jīng)12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，凝膠成像系統(tǒng)拍照后分析微衛(wèi)星位點(diǎn)的條帶變化。選取變化

3、明顯的樣本測序分析堿基序列變化。結(jié)果:在PMS1內(nèi)含子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了一段(GT)11的片段，分別在其上游和下游側(cè)翼序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物，得到一段203bp的微衛(wèi)星位點(diǎn)。在選取的22只MD發(fā)病雞中，有16只雞的腫瘤組織較正常組織表現(xiàn)出不同的MSI變化，MSI陽性率為72.8％，片段長度有增加也有減小。其中一只雞測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)核心序列發(fā)生變化，側(cè)翼序列亦有堿基插入。
　　 試驗(yàn)二，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，提取健康雞的心、肝、脾、肺、腎、血液

4、、肌肉、法氏囊、骨髓組織及發(fā)病雞的腫瘤組織mRNA，分析PMS1在21日齡雛雞各種健康組織轉(zhuǎn)錄水平的差異及腫瘤組織較正常組織表達(dá)量的變化。PMS1mRNA在各組織的定量結(jié)果顯示:在分析的各組織中，mRNA在肌肉中表達(dá)最多，法氏囊和骨髓次之，在肺中表達(dá)最少。肌肉與心、脾的差異顯著(P＜0.05)，與肺，血液的差異極顯著(P＜0.01)。肝與其他各組織無明顯差異。馬立克腫瘤發(fā)生后，PMS1在心、肝、脾、肺、腎中的表達(dá)量增加幾十至幾百倍不等。