熱應激對三個品系錦鯉非特異性免疫及HSP70基因表達的影響.pdf

1、為研究各品系錦鯉的抗逆機理、相互間的抗逆差別,本試驗以紅白錦鯉、昭和錦鯉、黃金錦鯉為研究對象,探討持續(xù)熱應激下三個品系錦鯉非特異性免疫指標和HSP70基因的表達量的變化。試驗按3.5℃/h的速度將水溫從25℃升至32℃(升溫時間為2h),在32℃條件下持續(xù)應激24h。分別于應激前、應激后0、4、8、12、16、20、24h取樣,測定血漿補體蛋白3(C3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、堿性磷酸酶(AKP)、髓過氧化物酶(M

2、PO)、全血呼吸爆發(fā)以及心臟組織HSP70基因的相對表達量。
　　 結(jié)果如下:(1)熱應激下三個品系錦鯉全血呼吸爆發(fā)與應激前相比均沒有顯著性的差異(P＞0.05),應激前與應激后的整個過程中,昭和錦鯉和紅白錦鯉呼吸爆發(fā)活力顯著性高于黃金錦鯉(P＜0.05)。(2)熱應激下黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿C3含量增加,應激12～24h血漿C3的濃度顯著性地高于應激前的水平(P＜0.05)。熱應激下昭和錦鯉血漿C3含量降低,應激8～20h顯著

3、性低于應激前的水平(P＜0.05)。應激前昭和錦鯉血漿C3含量顯著性高于紅白錦鯉和黃金錦鯉(P＜0.05),而應激結(jié)束時昭和錦鯉血漿C3顯著性低于黃金錦鯉(P＜0.05),低于紅白錦鯉(P＞0.05)。(3)熱應激后三個品系錦鯉血漿SOD活力均沒有顯著性的差異(P＞0.05)。熱應激前后的整個實驗過程中,黃金錦鯉血漿SOD活力顯著性高于紅白錦鯉和昭和錦鯉(P＜0.05)。(4)熱應激下,黃金錦鯉血漿MDA含量總體呈下降趨勢,應激8～24

4、h黃金錦鯉血漿MDA顯著性低于應激前的水平(P＜0.05)。紅白錦鯉血漿MDA含量先上升后降低,應激16h時顯著高于應激前的水平(P＜0.05)。熱應激后昭和錦鯉血漿MDA呈上升趨勢,應激0、8、16～24h時顯著性高于應激前的水平(P＜0.05)。應激前,黃金錦鯉血漿MDA顯著性高于紅白錦鯉和昭和錦鯉,而在應激結(jié)束時昭和錦鯉血漿MDA顯著性高于紅白和黃金錦鯉(P＜0.05)。(5)應激后黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿AKP均高于應激前的水平,

5、應激后8～24h黃金錦鯉顯著性的高于應激前的水平(P＜0.05),應激后12～16h紅白錦鯉顯著性的高于應激前的水平(P＜0.05)。應激后昭和錦鯉血漿AKP均低于應激前的水平,應激后20h顯著性低于應激前的水平(P＜0.05)。應激前和應激后0～4h,血漿AKP大小為昭和錦鯉＞紅白錦鯉＞黃金錦鯉,應激后8-24h血漿AKP大小為紅白錦鯉＞昭和錦鯉＞黃金錦鯉。(6)熱應激后黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿MPO與應激前的水平相比均無顯著性的變化(

6、P＞0.05)。應激后昭和錦鯉血漿MPO的水平均高于應激前的水平,應激后12、20～24h顯著性高于應激前的水平(P＜0.05)。在整個實驗過程中,黃金錦鯉血漿MPO活性均低于昭和錦鯉和紅白錦鯉,除了應激后4h和8h。(7)熱應激后,三個品系錦鯉HSP70mRNA的表達量具有相似的變化趨勢。應激Oh時HSP70mRNA的表達量顯著性上升(P＜0.05),并且達到整個過程的峰值,黃金錦鯉、紅白錦鯉、昭和錦鯉的表達量分別提高到應激前的78.

7、7、27.8和9.9倍。應激4～16h,HSP70mRNA的表達量恢復到應激前的水平,應激20h時,HSP70mRNA的表達量再次升高。在三個品系錦鯉之間,應激后0、20h,HSP70mRNA的相對表達量為黃金錦鯉＞紅白錦鯉＞昭和錦鯉:應激后24h為紅白錦鯉＞黃金錦鯉＞昭和錦鯉,其他時間三個品系間無顯著性差異。結(jié)果表明:熱應激下三個品系錦鯉非特異性免疫指標和HSP70mRNA表達呈現(xiàn)不同的變化。熱應激顯著性地誘導了三個品系錦鯉HSP70

8、mRNA的表達,誘導了黃金錦鯉和紅白錦鯉血漿補體C3和AKP的合成,以及昭和錦鯉MPO的合成。結(jié)合實際生產(chǎn)中三個品系錦鯉抗病抗逆差異,我們可以推斷熱應激下誘導合成的HSP70、C3、AKP和MPO可能在機體抗逆過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 為進一步研究HSP70在魚類抗應激反應中的作用機理,本研究采用5'RACR和3'RACE的方法克隆了錦鯉HSP70基因的全長序列,該序列長度為2289bp,編碼643個氨基酸。HSP70蛋白

9、預測分子質(zhì)量為70.46kD,理論等電點為5.47,整個蛋白帶負電荷,在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。氨基酸序列分析顯示,錦鯉HSP70具有HSP70家族的3個簽名序列,以及HSP70家族細胞質(zhì)特征基序EEVD和靠近C端的1個四肽序列GGMP。同源性分析發(fā)現(xiàn)錦鯉HSP70與其他生物的HSP70序列具有較高的同源性,與草魚HSP70氨基酸序列相似性最高達97.67%,與無脊椎動物果蠅的相似性都高達73.04%。錦鯉HSP70蛋白無明顯跨膜區(qū)域,無信號肽