小麥抗白粉病基因Pm6的精細定位及其候選基因的克隆.pdf

1、小麥白粉病是由小麥白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的世界性病害，嚴重影響小麥的產(chǎn)量，而與化學防治相比，培育和推廣抗病品種是防治病害最經(jīng)濟有效且環(huán)保的措施。到目前為止，人們已經(jīng)鑒定了60個抗白粉病基因或者位點，但是僅Pm3得到了成功的克隆。更多抗白粉病基因的克隆不但有助于小麥抗白粉病基因工程改良，也有助于深入了解小麥抗病的分子機制。普通小麥近緣物種提莫菲維小麥(Triticum timophee

2、vii，2n=4x=28，AAGG)是重要的小麥抗白粉病抗源，其中Pm6基因已從提莫菲維小麥轉移到普通小麥背景中，并且被廣泛地應用于小麥抗白粉病育種。盡管Pm6基因的毒性小種在很多地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)，但是該基因在田間表現(xiàn)出很好的成株期抗性，尤其是與其他抗白粉病基因如Pm2聯(lián)合使用抗性更為突出。成株抗性由于其抗性持久、抗譜廣而越來越受到人們的重視，在小麥抗白粉病育種方面有較高的應用價值。為了更好地研究和利用Pm6基因，本研究在前期對Pm6基因初

3、步定位的基礎上，通過比較基因組學分析，開發(fā)基于麥類EST的STS標記和保守標記，精細定位Pm6基因，確定該基因在模式植物中的共線區(qū)域，預測共線區(qū)域內(nèi)的基因，確定并克隆Pm6的候選基因。主要結果如下：
　　 ⑴基于共線關系分析的分子標記開發(fā)和Pm6基因的精細定位。在前人的研究中，Pm6基因定位在2BL，F(xiàn)L0.50-1.00的物理區(qū)域內(nèi)，而模式植物水稻(Oryza sativa L.)和短柄草(Brachypodium dista

4、chyon)的基因組信息及大量的麥類EST資源為通過比較基因組學的方法開發(fā)標記對Pm6基因的精細定位提供了豐富的資源。因此，本研究，通過比較基因組學的方法首先將小麥定位在2BL FL0.50-1.00物理區(qū)域內(nèi)的所用EST序列與水稻基因組進行比較，找出與水稻第4染色體上的基因同源的小麥EST開發(fā)STS標記，在兩個F2作圖群體：IGVI-465/Prins(包含1816個單株)和IGVI-466/Prins(包含891個單株)，對Pm6基

5、因進行比較作圖，篩選得到8個標記與Pm6緊密連鎖(CINAU117、CINAU132、CINAU133、CINAU135、CINAU136、CINAU139、CINAU142和CINAU144)。在IGVI-466/Prins群體中將Pm6定位于兩個STS標記CINAU117和CINAU139之間。進一步利用定位在Pm6兩側的8個STS標記對應的EST與模式植物水稻和短柄草的基因組進行比較分析，確定它們在兩個基因組中的共線區(qū)域，以定位在

6、兩個基因組共線區(qū)域內(nèi)的基因與麥類作物(主要包括普通六倍體小麥、一粒小麥、大麥、黑麥、燕麥、粗山羊草)的EST。比對，搜索出同源的麥類EST，根據(jù)這些EST開發(fā)保守標記和COS(Conserved Orthologous Set)標記，從中篩選出11個保守標記和9個COS標記在抗、感親本間表現(xiàn)多態(tài)，聯(lián)合兩個F2群體對Pm6進行精細定位，最終將共29個標記定位于Pm6基因所在的區(qū)域內(nèi)。其中，在IGVI-466/Prins群體中總共有27個標

7、記與Pm6連鎖，14個標記與Pm6共分離；在IGVI-465/Prins群體中共有15個標記與Pm6連鎖，最近的標記與Pm6的連鎖距離為1.0 cM。根據(jù)所有連鎖標記在兩個群體中的比較作圖，同時結合標記在水稻和短柄草基因組中定位分析，最終將Pm6基因界定在兩個保守標記CINAU123和CINAU127之間。
　　 ⑵水稻和短柄草基因組中Pm6基因的共線區(qū)域分析、基因預測及候選基因的確定。將29個與Pm6基因連鎖的標記所對應的ES

8、T序列分別在水稻和短柄草基因組中進行序列比對搜索和定位，結果發(fā)現(xiàn)：29個EST中，89.6％和79.3％能夠分別在短柄草的Bd5染色體長臂和水稻的第4染色體長臂上找到相應的同源基因，這些標記分布在短柄草Bd5染色體長臂大約5.6 Mb的區(qū)域內(nèi)(從第21，159，780 bp到第26，682，408 bp之間)；在水稻第4染色體長臂上對應的區(qū)域大約6.0 Mb(從第27，802，151 bp到第33，785，309 bp之間).比較這些連

9、鎖標記在三個基因組中的排列順序發(fā)現(xiàn)：在水稻和短柄草中這些標記的排列順序具有很強的保守性，但在小麥與水稻或者小麥與短柄草的比較中均發(fā)現(xiàn)有基因重排的現(xiàn)象。對與Pm6基因連鎖最緊密的兩側標記CINAU123和CINAU127之間的區(qū)域對應的水稻和短柄草基因組的同源區(qū)段進行基因預測和分析，發(fā)現(xiàn)在這個同源區(qū)域內(nèi)存在一個含有抗病基因保守結構域的基因簇，即富含亮氨酸的類受體蛋白激酶基因簇(LRR-RLK)，并將LRR-RLK基因簇確定為Pm6的候選同

10、源基因。
　　 ⑶Pm6候選基因TaLRR-RLK的克隆。為了在小麥中克隆LRR-RLK基因，對水稻和短柄草的LRR-RLK基因成員及其與之同源的麥類EST序列進行比較分析，根據(jù)該基因簇保守的外顯子區(qū)域設計引物，首先從含Pm6基因的漸滲系IGVI-465中分離LRR-RLK基因的部分序列，然后根據(jù)這個序列設計RACE引物。通過RACE方法成功地從IGVI-465中克隆了小麥中LRR-RLK基因的全長序列(命名為TaLRR-RLK

11、)。TaLRR-RLK的全長ORF為3045 bp，編碼1014個氨基酸；其編碼的蛋白質在N端有一個信號肽，一個疏水的跨膜域，胞外有11個LRR重復基序，胞內(nèi)有一個保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域。TaLRR-RLK與GFP融合蛋白的亞細胞定位結果表明，TaLRR-RLK主要定位在細胞核和細胞膜中。利用Q-PCR技術分析該基因在不同生育期及不同脅迫誘導下的表達特征，結果表明，該基因在IGVI-465的二葉期(感病階段)到四葉期(抗病階

12、段)之間有明顯的上調(diào)表達，與Pm6的抗性表型一致，而在感病親本Prins的不同生育期中表達沒有差異；TaLRR-RLK在抗、感親本中均受到白粉菌的誘導上調(diào)表達；同時SA能夠明顯誘導該基因的表達，推測該基因可能通過SA介導的信號通路參與對白粉菌的抗性反應。
　　 ⑷Pm6基因附近一個保守的類受體蛋白激酶基因TaRPK的克隆。在前人的研究中，發(fā)現(xiàn)RFLP標記BCD135與Pm6緊密連鎖，并且在水稻和大麥基因組的該標記位點附近同時存在

13、兩個保守的基因：一個編碼未知功能的蛋白，紀劍輝(2008)利用大麥中該基因的序列成功開發(fā)了STS標記，并且該標記與Pm6緊密連鎖；而另一個保守的基因是一個類受體蛋白激酶基因(RPK)，該基因在禾本科植物及雙子葉植物中具有很強的保守性。本研究根據(jù)大麥RPK的CDS序列開發(fā)了5個STS標記，5個標記在Pm6的作圖群體、小麥近緣物種及其這些物種在中國春背景下的二體異附加系中的擴增結果表明，該基因在兩個作圖群體中(IGVI一465/Prins和

14、IGVI-466/Prins)均與Pm6基因緊密連鎖；RPK基因在大麥BETZES(HH)、黑麥BLANCO(RR)、Ae.speltoides(SS)、Ae.longissima(SlSl)、Ae.geniculata(MgMg)、Ae。peregrina(SpSpUpUp)及Pm6的原始親本T.timopheevii(AAGG)中顯示出高度的保守性，能夠特異地追蹤2H、2R、2S、2Sl、2Mg、2Sp.2Up和2G染色體，因此，R

15、PK基因可作為小麥及其近緣物種第二部分同源群染色體的標記基因。為了克隆小麥的RPK基因，本研究利用STSRPK-F1/R4引物篩選小麥品種小偃54 BAC文庫，得到小麥中的RPK基因全長序列，命名為TaRPK。進一步地根據(jù)小偃54中TaRPK的序列設計引物，通過同源克隆的方法在含Pm6基因的漸滲系IGVI-465中克隆到TaRPK基因分別為1650 bp和1275 bp的gDNA和cDNA序列，命名為TaRPK1。TaRPK1的gDNA

16、包含有4個外顯子和5個內(nèi)含子；編碼424個氨基酸的蛋白質，結構預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含一個信號肽和一個跨膜結構域但缺少典型的胞外結構，胞內(nèi)是一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域。在IGVI-465基因組中，TaRPK1基因存在三個不同的拷貝，分別來自2A和2D染色體以及2G，其中只有來自2G的拷貝TaRPK1-2G具有轉錄活性，并且是一個選擇性剪切的基因，有兩種不同的剪切方式。TaRPK1-2G主要定位在細胞核和細胞膜中。利用Q-PCR分析Ta