副豬嗜血桿菌的分離鑒定和防控措施(恢復(fù))(恢復(fù))

1、<p>　　分類號： 學校代碼： </p><p>　　UDC： 研究生學號： </p><p>　　密 級： </p><p><b>　　碩士專業(yè)學位論文</b>&

2、lt;/p><p>　　副豬嗜血桿菌病分離鑒定和防治措施</p><p>　　學 位 申 請 人： 柏建東 </p><p>　　指 導(dǎo) 教 師： 副教授 </p><p>　　合 作 教 師： 研究員 </p><p>　　專業(yè)學位類別：

3、 獸醫(yī)碩士 </p><p>　　專業(yè)學位領(lǐng)域： </p><p><b>　　2015年4月</b></p><p>　　論文題目： 副豬嗜血桿菌病分離鑒定及防治措施 </p><p>　　專 業(yè)： 獸醫(yī)碩士

4、 </p><p>　　研 究 生： 柏建東 </p><p>　　指導(dǎo)教師： 副教授 </p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　副豬嗜血桿菌病,其英文名字是（Haemophiluspa

5、rasuis，HPs），由副豬嗜血桿菌引起的重要的細菌性傳染病，導(dǎo)致保育仔豬產(chǎn)生多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎，使養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大的財產(chǎn)損失。為探索出其有效的防治措施，本研究利用臨床診斷、病理解剖以及實驗室診斷等方法，從幾例臨床癥狀、病例剖檢疑似為副豬嗜血桿菌病豬體內(nèi)分離到革蘭氏陰性可疑菌，然后進行鏡檢、生化試驗、基因測序等手段確定其為副豬嗜血桿菌。但由于副豬嗜血桿菌體外培養(yǎng)條件嚴格，生長繁殖受到抑制，嚴重影響了疫苗的大量生產(chǎn)。為了探索副豬嗜血桿菌

6、培養(yǎng)的液體條件，本試驗通過副豬嗜血桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)，確定該菌的最適培養(yǎng)條件為胰蛋白胨15.0 g ,大豆蛋白胨5.0 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖2.5 g、鈣離子0.04-0.06 %、磷離子0.02-0.03 %、滅菌蒸餾水1000 mL, pH 7.2-7.4時在5 %的CO2厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。通過藥敏試驗，篩選出對該豬場的患病仔豬具有針對性的敏感藥物，并通過對該菌的生物學特性、毒力、遺傳特征、免疫原性進行檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株符合

7、作為滅活疫苗的特征。并通過AlCl3作為佐劑來制備副豬嗜血桿菌自</p><p>　　關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌， 分離鑒定 藥敏試驗 疫苗</p><p><b>　　論文類型：其他</b></p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Haemophilus pa

8、rasuis disease, whose name is HPs, caused by the H. parasuis important bacterial diseases, resulting in nursery pigs produce multiple serositis and arthritis that suffered huge aquaculture damage to property. In order t

9、o explore its effective control measures, this study, clinical diagnosis, and anatomic pathology laboratory diagnostic methods, clinical symptoms from a few cases, suspected cases of necropsy Haemophilus parasuis isolate

10、d Gram-negative pigs in vivo to suspicious bac</p><p>　　Key words: Haemophilus parasuis isolation and identification drug allergy testing vaccine</p><p><b>　　第1章 文獻綜述</b><

11、;/p><p><b>　　1.1病原學</b></p><p>　　副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPs)屬巴氏桿菌科，嗜血桿菌屬，是豬上呼吸道的一種常見菌，在1910 年，德國科學家Glasser 在漿膜性纖維素性胸膜炎、心包炎以及腦膜炎豬的漿液性分泌物中的首次發(fā)現(xiàn)了一種革蘭氏陰性菌，所以副豬嗜血桿菌病又稱Glasser，s 病，由Scherm

12、er 和Ehrlich 在1922年首次分離出來[1-3]。副豬嗜血桿菌是一種具有多種形態(tài)、不運動、NAD 依賴型的短小桿菌，體外培養(yǎng)要求嚴格,在油鏡下觀察可見球桿、細長、甚至成絲狀的形態(tài)，通?？梢钥匆娗v膜，但是在體外擴大培養(yǎng)易丟失掉[4]。在對副豬嗜血桿菌病的病原進行生化鑒定描述中，早期的研究表明其與生長需要X(鐵卟啉)和V(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)兩種因子的豬嗜血桿菌極其相似[5]。但是，在Biberstein 和White 的研究中

13、證實副豬嗜血桿菌的生長只需要V 因子(NAD)[6]。由此副豬嗜血桿菌被視為一種新的細菌名稱。因為根據(jù)嗜血桿菌屬的公認命名慣例，使用前綴“para-”為生長不需要X-因子的微生物命名，DNA-DNA雜交實驗結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌是一群遺傳均一的細菌，其中大</p><p><b>　　1.2流行病學</b></p><p>　　副豬嗜血桿菌曾一度被認為是由應(yīng)激所引起的

14、，?？梢詮呢i的鼻腔粘液、氣管分泌物中分離到，是豬上呼吸道的一種正常定居菌，一般無任何臨床癥狀，只有當環(huán)境發(fā)生改變或者引起免疫抑制因素的時候，才會引起嚴重的全身性疾病，因此，副豬嗜血桿菌病一度被認為是應(yīng)激性疾病。常出現(xiàn)厭食、精神沉郁、被毛粗亂、跛行、呼吸困難、振顫及共濟失調(diào)等臨床癥狀，剖檢病變：可見腹膜炎、心包炎、胸膜炎，全身漿膜表面出現(xiàn)漿液性纖維素性以及纖維素性化膿性滲出。仔豬病理變化：胸腹腔纖維素滲出嚴重，各臟器嚴重粘連，腹水較多，心

15、包腔內(nèi)大量纖維蛋白凝集嚴重，使心內(nèi)外膜與之粘連無法分開，肺尖葉、心葉實變，肝出血，腦充血；有的仔豬臟器有纖維素沉著，肺實變，但病變相對較輕；還有的仔豬肝臟有白色壞死灶，肺臟有出血點，其他病變不明顯。副豬嗜血桿菌只感染豬，帶菌豬和慢性感染豬是本病的主要傳染源，主要通過豬群間的相互接觸、空氣飛沫傳染以及污染物來傳播。該病可見于豬的整個生長階段，3-10 周齡的豬最易感染。該病在保育期的發(fā)生流行與母源抗體水平下降有關(guān)，同時也與豬場的飼養(yǎng)管理因

16、素有關(guān)，由侵入豬只菌數(shù)，豬只的應(yīng)激反應(yīng)以及免疫狀態(tài)所決定。其發(fā)病率一般在10%～</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)，在SPF動物（即無特定病原體動物，是不攜帶潛在感染或條件致病菌，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動物）或高度健康的畜群中引入副豬嗜血桿菌，會導(dǎo)致高發(fā)病率與高死亡率的疾病，并且可以影響到豬生產(chǎn)過程中的各個階段[13]。天氣驟冷、長途運輸以及豬群擁擠都會引起副豬嗜血桿菌病的急性暴發(fā)。合并感染也是該病發(fā)生的重要

17、原因，如在不同畜群中混養(yǎng)，或在豬群中引入新種豬[14-16]。</p><p>　　早期斷奶與三點生產(chǎn)系統(tǒng)等生產(chǎn)方式，使得副豬嗜血桿菌強毒在豬體內(nèi)早期定居和豬群中的傳播，改變了豬群中副豬嗜血桿菌的流行病學特征[17]。因此，了解當?shù)刎i場中副豬嗜血桿菌的流行病學，是防制豬群感染副豬嗜血桿菌的關(guān)鍵。</p><p>　　副豬嗜血桿菌有15 種血清型，并且其分布有很明顯的地域特點[18-19]，

18、在德國，2，4 血清型最為流行[20]，日本、美國、西班牙等地為血清型4、5 最為流行[21-23]，澳大利亞的血清型5、13 最為流行[24-25]，在丹麥分離的菌株也主要為5 型和13 型[26]，而在我國副豬嗜血桿菌血清型4、5、12、13 型最為流行[27]。</p><p><b>　　1.3分離鑒定</b></p><p>　　根據(jù)豬的臨床癥狀和剖檢病理變

19、化，結(jié)合細菌的分離鑒定進行綜合分析是確診副豬嗜血桿菌病最有效的方法，但是這往往不能成功。由于副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)過程中非常容易死亡，是一種十分難于培養(yǎng)的細菌。而且在接受分離前病豬往往接受過大量的抗生素治療，這也使該菌的分離率大大降低。加拿大安大略省的診斷實驗室用回歸分析法(Retrospctive analysis of submission)分析表明副豬嗜血桿菌的真實發(fā)病率可能為報道的10 倍之多，其中很大原因就是因為難以確認采集來的標

20、本中是否存在副豬嗜血桿菌。副豬嗜血桿菌是NAD 依賴型細菌，在其培養(yǎng)過程中需為其提供V-因子，傳統(tǒng)使用巧克力瓊脂平板[28]，但是由于副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)過程中容易遭受血液來源不同或者熱處理的因素的影響，因此，在副豬嗜血桿菌的TSA 培養(yǎng)基上添加適量的血清與NAD會取得更好的效果[29-31]。向培養(yǎng)基中添加適量的林可霉素或萬古霉素等抗生素，通過平板稀釋技術(shù)可以提高副豬嗜血桿菌的分離率，但是也會在一定程度上抑制副豬嗜血桿菌的生長，為減少雜

21、菌的污染，增加分離到副豬嗜血桿菌的機率，采集病料應(yīng)當選擇處于疾病急性期的漿膜表面物質(zhì)或滲出的</p><p><b>　　1.4防治措施</b></p><p>　　副豬嗜血桿菌一般利用免疫接種與抗生素相結(jié)合治療方案，根據(jù)每一個豬群中感染的流行病學調(diào)查，確定免疫接種程序。通過提前斷奶、減少豬群流動、杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況、加強豬舍的衛(wèi)生管理、控制飼料的種類及其來源

22、等措施防治副豬嗜血桿菌。雖然副豬嗜血桿菌早期對大多數(shù)抗生素是非常敏感的，但是近幾年，該病原菌的耐藥性現(xiàn)象越來越明顯，大量研究表明，副豬嗜血桿菌病爆發(fā)時，抗生素預(yù)防或口服藥物治療已經(jīng)失去了效果[32-34]。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，應(yīng)當立即采用大劑量的抗生素對整個豬群通過口服以外的方式進行藥物治療，而不僅僅是對出現(xiàn)臨床癥狀的豬用藥[35]。早期使用青霉素進行治療，但是有報道稱，該菌對青霉素的耐藥性也日漸增強[36]。大多數(shù)的副豬嗜血桿菌對氨芐青

23、霉素、氟喹諾酮類、頭孢菌素類、慶大霉素和增效磺胺類藥物敏感，但同時大多菌株對四環(huán)素、紅霉素、林可霉素有抵抗力。近幾年，國內(nèi)關(guān)于副豬嗜血桿菌耐藥性的報道逐漸增多，徐引弟等[37]對河南副豬嗜血桿菌分離株的藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌對頭孢類藥物敏感性最高，其次為環(huán)丙沙星、四環(huán)素和丁胺卡那，對新霉素、阿莫西林、鏈霉素及復(fù)方新諾明均耐藥。方泉明等[38]報道江西副豬</p><p>　　通過將副豬嗜血桿菌徹底的清除出豬群以控

24、制該病發(fā)生的方式并不可取。首先，一周齡的仔豬的鼻粘膜中可能就有副豬嗜血桿菌定居，所以，僅僅通過早期斷奶來根除該菌的方法不可能成功。Clark 等人對當時集中早期斷奶法進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有同時對仔豬從各種用藥途徑給予大劑量的抗生素，副豬嗜血桿菌才能徹底得到根除，但是這種方法并不適用于實際生產(chǎn)[41]。另一方面即使副豬嗜血桿菌已被徹底清除出現(xiàn)有豬群，但是由于該豬群缺乏對副豬嗜血桿菌的免疫力，在這之后進入混養(yǎng)的帶菌豬與生產(chǎn)后期潛伏有該菌的

25、豬，均可能引起潔凈豬發(fā)病，造成嚴重的經(jīng)濟損失。如要向一個豬群中引入健康狀況不同的新豬群時，首先應(yīng)當隔離飼養(yǎng)，且維持一個足夠長的適應(yīng)期，使那些沒有進行免疫接種但同時有感染條件飼養(yǎng)的豬群建立起保護性免疫力[42]。</p><p>　　對副豬嗜血桿菌的控制可以用商業(yè)疫苗或制作自家苗[43-45]，大量報道指出，通過商業(yè)疫苗接種或使用菌株特異性滅活菌苗，可以成功地控制該病的發(fā)生[46-48]，但是，也有使用滅活菌苗預(yù)防

26、失敗的事例，這可能是受血清型多樣性及未分型株所占比例較大的影響。母豬接種副豬嗜血桿菌疫苗可在一定程度上預(yù)防仔豬的早期感染。即讓健康仔豬預(yù)先接觸低毒力甚至是無毒力的副豬嗜血桿菌菌株，可明顯提高仔豬對有毒菌株的抵抗能力。但是由于副豬嗜血桿菌的血清型眾多且致病性不同，所以最好借助于實驗室手段對引起病癥的病原體做血清學分型，以便快速有效的控制疫病在豬群中蔓延，而且可避免盲目使用疫苗帶來的額外經(jīng)濟損失[49]。</p><p&

27、gt;　　實際生產(chǎn)中，防治該病預(yù)防是關(guān)鍵，首先，要加強對豬場（舍）的環(huán)境衛(wèi)生的管理，加強豬舍的通風對流，保持豬只適宜的生活環(huán)境，加強豬場的環(huán)境衛(wèi)生消毒工作；另一方面，要加強對豬只的飼養(yǎng)管理，要堅持實行“全進全出”制度，做到嚴格分群飼養(yǎng)，還要盡量減少各種對豬只的應(yīng)激因素；最后，要做好獸醫(yī)防疫工作，強化母代的免疫力與天然的免疫力，同時也要做好通過疫苗來預(yù)防該病發(fā)生[50-51]。</p><p>　　1.5防治目的與

28、意義</p><p>　　本研究主要針對某豬場的副豬嗜血桿菌病的流行現(xiàn)狀，對該豬場副豬嗜血桿菌疑似病例的病料進行采集，通過平板劃線、革蘭氏染色、PCR鑒定等實驗室常規(guī)分離方法確定該豬場的致病菌為副豬嗜血桿菌，并進一步對其進行優(yōu)化培養(yǎng)，確定其最適發(fā)酵條件，通過藥敏試驗、確定對該豬場具有針對性的治療方案。</p><p>　　由于副豬嗜血桿菌的區(qū)域性很強，普通的商品疫苗不能很好的對每個地方的副

29、豬嗜血桿菌進行完全的保護。在一個特定的地域，知道該區(qū)域的副豬嗜血桿菌的血清型對于防治該區(qū)域的副豬嗜血桿菌病至關(guān)重要，因此，本試驗從該豬場分離出的具有地方性的副豬嗜血桿菌菌株制成氯化鋁滅活苗，克服了普通商品疫苗由于血清型差異而造成的免疫效果不佳。</p><p>　　從該實驗中可以明顯看出雖然氯化鋁滅活苗對副豬嗜血桿菌病的預(yù)防效果較好，但只適用于原場或該區(qū)域的豬場。若想要大范圍應(yīng)用，還需要進一步評估其有效性。<

30、;/p><p>　　第二章 病原菌的分離與鑒定</p><p>　　副豬嗜血桿菌病，其英文名字是（Haemophilusparasuis，HPs）是由副豬嗜血桿菌感染引起多發(fā)性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、肺炎、胸膜炎、心包炎、腦炎等病癥，病豬死亡率較高。其危害對象主要是仔豬和青年豬，常引起病豬發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難和多發(fā)性漿膜炎等癥狀。</p><p>　　由于副豬嗜血桿菌

31、血清型有15種血清型，且不同地區(qū)血清型具有明顯的地域特點，而且容易產(chǎn)生抗藥性。因此僅僅通過商品疫苗和抗生素進行防治具有較大的難度，而且由于商品疫苗的血清型較為單一，但副豬嗜血桿菌的血清型較多，且血清型之間無交叉免疫性，針對性差，所以疫苗的預(yù)防非常困難。</p><p>　　本研究采用平板劃線技術(shù)，利用選擇性培養(yǎng)基對疑似菌進行分離鑒定從而確定該豬群的中副豬嗜血桿菌的優(yōu)勢血清型，并進行藥敏試驗，選擇副豬嗜血桿菌的敏感

32、藥物，為該地區(qū)副豬嗜血桿菌的治療及藥物預(yù)防提供參考，并為研制滅活苗奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2.1試驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1試驗儀器</b></p><p>　　冰箱（BCD-252KU；河南新飛電器有限公司）；</p><p>　　恒溫培養(yǎng)箱（HWS-2

33、50；寧波江南儀器制造廠）；</p><p>　　無菌接種箱（WJ-J2X；濟南杰康凈化設(shè)備廠）；</p><p>　　雙目生物顯微鏡（Nikon 80i；日本尼康公司）；</p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（RXZ-2000 C；寧波江南儀器制造廠）；</p><p>　　移液器（eppendorfresearchplus；河南世佳儀器設(shè)備

34、貿(mào)易有限公司）；</p><p>　　高速低溫離心機（Eppendorf5430R；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司）</p><p>　　真空冷凍干燥機(SHZ-D(III)；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司)；</p><p>　　智能不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZM-60KCS；河南瑞源化驗儀器有限公司)；</p><p>　　鼓風干燥箱（1

35、01-2；上海本杉儀器設(shè)備有限公司）;</p><p>　　酸度計（PHS-3C；西安匯鴻環(huán)?？萍加邢薰荆?lt;/p><p>　　PCR儀(Eppendorf Mastercycler nexus；艾本德中國有限公司)；</p><p>　　-86℃超低溫冰箱（TH-86-340-LA；河南瑞源化驗儀器有限公司〉；</p><p>　　電子分

36、析天平（FA1004A；成都市科恒達儀器設(shè)備有限公司）；</p><p>　　純水機（TPD1-10UV2；菏澤開發(fā)區(qū)海大儀器設(shè)備有限公司）；</p><p>　　接種環(huán)、酒精燈、平板、瓊脂斜面、手術(shù)刀、手術(shù)剪、眼科鑷。</p><p><b>　　2.1.2試驗試劑</b></p><p>　　TSA平板（HB7026

37、-9；青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p><p>　　TSB平板（HB7026-11；青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p><p>　　葡萄糖蛋白胨瓊脂(DT培養(yǎng)基,不含中和劑)( 上?？畦b生物科技有限公司)</p><p>　　麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（吉林省賽凱生物技術(shù)有限公司）</p><p>　　EC肉湯培養(yǎng)基(廣州

38、市益滿生物科技有限公司)</p><p>　　PCR相關(guān)試劑為山東青島海博生物技術(shù)有限公司提供</p><p><b>　　2.1.3試驗病料</b></p><p>　　2015年10月，某豬場的仔豬突然發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、厭食，體溫升高，跛行，次日死亡。部分病例體溫升高不明顯，稍有咳嗽、拉稀，食欲減少。剖檢病理變化可見：胸腔、心包膜有大量

39、的纖維素性滲出；肺臟表面附有大量的滲出物，淋巴結(jié)異常腫大，呈暗紅色，切開淋巴結(jié)可見有大理石樣斑紋；十二指腸、腎臟均可見有點狀出血。畜主按鏈球菌病、腫病治療無效。根據(jù)以上癥狀，懷疑為副豬嗜血桿菌病，采集病豬肺臟、脾臟、血液待檢。</p><p><b>　　2.2試驗方法</b></p><p>　　2.2.1病原菌的初篩</p><p>　　包

40、扎：計算出所要用的玻璃器皿的數(shù)量，并按要求包扎好。</p><p>　　稀釋用生理鹽水的準備：根據(jù)要求，計算出稀釋用的生理鹽水，并準備好。</p><p><b>　　培養(yǎng)基的準備。</b></p><p>　　滅菌：按要求將準備的器皿、生理鹽水及培養(yǎng)基等進行滅菌。</p><p>　　無菌操作箱的滅菌：操作前進行無菌操

41、作箱的滅菌。</p><p>　　無菌操作：劃線分離的方法分離微生物；稀釋涂布分離的方法分離微生物。</p><p>　　培養(yǎng)：按細菌要求進行培養(yǎng)。</p><p>　　接種：培養(yǎng)16 h，挑選單菌落接種到斜面試管。</p><p>　　斜面試管培養(yǎng)到對數(shù)期時放到冰箱保存。</p><p>　　在無菌接種箱中，用病變組

42、織塊分別涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基上，放置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16 h。</p><p><b>　　2.2.2鏡檢</b></p><p>　　挑選麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、TSA平板上典型的疑似單個菌落，進行涂片，革蘭氏染色，然后在油鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。</p><p&

43、gt;　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：</p><p>　　準備：取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。</p><p>　　涂片：先在載玻片上滴一滴無菌生理鹽水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。</p><p>　　晾干

44、：讓涂片在空氣中自然干燥。</p><p>　　固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以載玻片背面不燙手為宜）。</p><p>　　染色：將固定過的涂片放報紙上，滴加草酸銨結(jié)晶紫液，染1-2min。</p><p>　　水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。</p><p>　　媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。</p

45、><p>　　脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加95%乙醇脫色25-30s至流出液無紫色，立即水洗。</p><p>　　復(fù)染：滴加復(fù)紅復(fù)染2min，水洗。至此，革蘭氏染色結(jié)束。</p><p>　　實驗完畢后載玻片的處理：①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈。</p><p>　　1.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。</p><p>

46、;　　2.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2-3次。</p><p>　　3.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。</p><p>　　4.注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。</p><p><b>　　2.2.3純培養(yǎng)</b></p><p>　　在無菌接種箱中，用接種環(huán)挑取疑似菌株的單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基上，然后放置于37

47、℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，16 h后，取出并放入4 ℃冰箱備用。</p><p>　　劃線方法：方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線，選擇其中一種進行劃線。劃畢，將接種環(huán)燒灼滅菌，于皿底用蠟筆標記被檢材料名稱及日期，倒轉(zhuǎn)置恒溫箱中培養(yǎng)</p><p>　　倒平板：按無菌操作要求，在潔凈工作臺或在火焰旁操作，取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基（約500C），倒入無菌培養(yǎng)皿，倒量以鋪滿皿底

48、為限（15-20ml），平放待其冷卻凝固，備用。</p><p>　　劃線分離：使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板劃線分離劃線的方法多樣平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，目的是獲得單個菌落。 </p><p>　　平板劃線法：劃線后有單個菌落，便于觀察菌落的形態(tài)、溶血性等。方法左手拿瓊脂平板，使其與水平面成450角；右手拿鉑金耳，使之與水平面

49、平行，靠近酒精燈火焰操作。將接種環(huán)于酒精燈火焰中灼燒滅菌，待其冷卻后，蘸取欲檢材料少許，注意不要劃破瓊脂，不要劃得太疏，以免造成浪費，不要重復(fù)劃線，以免形成菌苔。</p><p><b>　　2.2.4生化試驗</b></p><p>　　將分離純化后的菌株進行以下各項生化試驗。</p><p>　　吲哚試驗：將試驗菌用蛋白胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)

50、16 h；在培養(yǎng)液中加入乙醚2-3ml，充分振蕩,使吲哚試劑溶于，靜置片刻（1-3min）,待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴（2ml）。呈玫瑰紅或紅色環(huán)狀物的為陽性,不變色的為陰。</p><p>　　甲基紅試驗：將試驗菌用葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16 h。沿管壁加入甲基紅試劑3-4滴紅色為陽性,橘紅色為弱陽性，黃色為陰性。</p><p>　　V.P試驗（二乙酰試

51、驗）：將試驗菌用葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16 h；加入40%KOH 10-20滴，再加入等量α-萘酚，用力振蕩（拔去棉塞）再放入37℃4h后再觀察,仍無色產(chǎn)生為陰。試驗時，強陽性者約5min后，可產(chǎn)生粉紅色反應(yīng)，長時間無反應(yīng)，置室溫過夜，次日不變?yōu)殛幮浴?lt;/p><p>　　糖發(fā)酵試驗：在無菌操作臺上，用接種針將待檢細菌單菌落接種于五糖微量反應(yīng)管，并封口標號，置于37℃恒溫培養(yǎng)16 h。產(chǎn)酸的判斷：使培養(yǎng)基

52、由紫色變?yōu)辄S色。產(chǎn)氣的判斷：有無氣泡。</p><p>　　接觸酶試驗：用接種環(huán)挑取細菌純培養(yǎng)物涂于潔凈的載玻片上，滴加30 %的過氧化氫溶液，停留30 s后，觀察試驗結(jié)果。若產(chǎn)生大量氣泡為陽性，否則為陰性[52]。</p><p>　　淀粉水解試驗：將肉湯液瓊脂121℃高壓滅菌15分鐘，冷至50℃時，傾注滅菌平板備用。取出平板，打開平皿蓋，用接種環(huán)取少量的待測菌，點接在培養(yǎng)基表面的表面用

53、記號筆標記，將接種后的菌種置于37＇恒溫箱中培養(yǎng)16 h取出平板，打開平皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個平板。菌落周圍如出現(xiàn)無色透明圈，這說明淀粉已經(jīng)被水解，表示該細菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小說明測試菌株水解淀粉能力的強弱。</p><p>　　2.2.5分子生物學鑒定</p><p>　　取分離菌株的液體培養(yǎng)液于 8 mL 離心管中，8000 r/m

54、in，4°C，離心10min,棄上清液，取沉淀，加入0.5mL DNA提取緩沖液（1mol/L Tris-HCl，pH 8.0）備用。單菌株DNA的提取采用Benzyl Chloride方法[53]。PCR引物27F和1492R序列為：5’-，5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)條件為：95°C變性5min；95°C 30s，56°C 30s，72°C 1min

55、30s，30個循環(huán)，72°C延伸3min。電泳檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結(jié)果通過BLASTN比對。</p><p>　　2.3實驗結(jié)果與分析</p><p><b>　　2.3.1病理解剖</b></p><p>　　解剖后為纖維性或漿液纖維素性腦膜炎、心包炎、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎和腹膜炎（見圖1）。多見漿液性或纖

56、維素性滲出，腹水、胸水量大且渾濁，部分肺臟與胸壁發(fā)生粘連，肺臟表面有纖維素性滲出，肺部腫脹、出血、淤血（見圖2）。</p><p><b>　　2.3.2鏡檢結(jié)果</b></p><p>　　從病變器官成功分離到一株革蘭氏陰性短小桿菌，該菌在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基中均未見生長，在TSA培養(yǎng)基中生長較好。可見圓形、無色透明、光滑濕潤、針尖大小、邊緣整齊的菌

57、落。詳見圖3。</p><p>　　革蘭氏染色后在光學顯微鏡下油鏡觀察，為革蘭氏陰性短桿菌，部分球桿狀。詳見圖4。</p><p>　　2.3.3生化試驗結(jié)果</p><p>　　將分離后的純菌液進行生化試驗，37℃培養(yǎng)16 h之后，生化試驗結(jié)果如下：病原菌吲哚試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陽性，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖發(fā)酵呈陽性，乳糖、甘露醇發(fā)酵呈陰性，接觸酶反應(yīng)為陽性，淀

58、粉反應(yīng)呈陰性。其試驗結(jié)果（詳見圖5-圖13），生化實驗結(jié)果（詳見表1），表明該分離菌符合副豬嗜血桿菌的生化特性。</p><p>　　表2 細菌的生化鑒定結(jié)果</p><p>　　注：“＋”為試驗呈陽性；“－”為試驗呈陰性。</p><p>　　2.3.4 PCR鑒定結(jié)果</p><p>　　經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司測序結(jié)果表明該菌為副豬

59、嗜血桿菌。經(jīng)PCR 檢測，樣品擴增出與陽性對照一致的822bp 大小的片段，電泳圖像詳見圖14。</p><p>　　圖14 分離株P(guān)CR 擴增結(jié)果</p><p>　　M: DL2000；1：陽性對照，2：陰性對照，3：為分離株P(guān)CR 結(jié)果</p><p>　　Fig.14.The results of isolates PCR amplification<

60、/p><p>　　M: DL2000; 1: positive control，2: negative control，3 isolates PCR results</p><p>　　根據(jù)該病原菌的菌落特征、鏡檢結(jié)果、生化試驗結(jié)果、PCR 檢測結(jié)果 ，可判斷該病原菌為副豬嗜血桿菌。</p><p><b>　　2.4討論</b></p>

61、;<p>　　2.4.1病料來源的選擇</p><p>　　該豬場每年總的生豬出欄數(shù)在2000頭左右，該市現(xiàn)有同等規(guī)模豬場500家左右，由于中小豬場在管理跟不上萬頭豬場，又因為養(yǎng)殖場的密度比較集中，所以一些類似于副豬嗜血桿菌這樣的機會性疾病的發(fā)病率相對較高，所以本實驗旨在對該地區(qū)的副豬嗜血桿菌進行防治，減少該地區(qū)養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。</p><p>　　本實驗所選擇的的豬場的規(guī)

62、模均為年出欄2000頭左右，基礎(chǔ)母豬在100頭左右，規(guī)模上在當?shù)鼐哂幸欢ǖ拇硇浴?</p><p>　　2.4.2副豬嗜血桿菌旳分離鑒定</p><p>　　副豬嗜血桿菌為兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，副豬嗜血桿菌病的臨床癥狀、剖檢病變和流行病學特征與豬的支原體性肺炎、鏈球菌病和傳染性胸膜肺炎等傳染病都有類似之處，并且這幾種疾病很容易混合感染，所以在臨床上很容易混靖。所以釆用副豬嗜血桿菌的

63、分離鑒定目前仍然是最有效的方法。但是，由于副豬嗜血桿菌的分離時間較長，分離率較低，同時還受到技術(shù)人員操作的熟練度的影響，而致使很多的臨床上分離不出來細菌，所以現(xiàn)在臨床上多運用PCR技術(shù)對副豬嗜血桿菌進行鑒定，PCR技術(shù)能夠快速，準確的對疾病進行診斷。</p><p>　　2.4.3副豬嗜血桿菌的分離方法 </p><p>　　副豬嗜血桿菌屬需氧或兼性厭氧，革蘭氏陰性菌，對培養(yǎng)基營養(yǎng)要

64、求較高，并且需要提供一定的CO2（5%左右）以促其生長。在對副豬嗜血桿菌分離時特別要注意分離樣本的選擇，副豬嗜血桿菌對大多數(shù)抗生素十分敏感，長期或者大量使用抗生素，會使體內(nèi)產(chǎn)生免疫，很難分離到病原菌，故應(yīng)盡量選擇沒有接受過抗生素藥物的病豬。一般從臨床病料中分離副豬嗜血桿菌很困難成功，因為在感染機體死亡后，副豬嗜血桿菌死亡速度加快，-4 ℃也僅能存活一周，故也很難分離獲得病原菌。通常情況下，選擇在解剖后6 h進行劃線分離，成功率可大大增加

65、。本實驗采用TSA選擇性培養(yǎng)基，當場解剖當場劃線分離，置于5% CO2培養(yǎng)箱，溫度37 ℃，培養(yǎng)16 h后，生長效果較好。</p><p><b>　　第三章 藥敏試驗</b></p><p>　　在養(yǎng)殖過程中病豬經(jīng)過診斷一旦懷疑是副豬嗜血桿菌病，就必須使用抗生素治療，但是在降低豬群的死亡率的同時，抗藥性的副嗜血桿菌也隨之增多，導(dǎo)致一旦停藥副豬嗜血桿菌病將再次大規(guī)模爆

66、發(fā)，且需要再次投放大量的抗生素藥物，增加藥物的殘留以及有可能產(chǎn)生耐藥性的風險。因此副豬嗜血桿菌分離菌株在不同地區(qū)血清型具有明顯的地域特點，不同地區(qū)不同血淸塑的副豬嗜血桿齒分離株對同一抗生素的敏感性存在著很大的差異，同一抗生素藥物對不同菌株的敏感性也具有很大的差異。因此，臨床用藥需在具體的藥敏試驗指導(dǎo)下進行，避免因為用藥不合理而致使耐藥菌株的產(chǎn)生。</p><p>　　當副豬嗜血桿菌病在豬場大規(guī)模爆發(fā)時，抗生素雖然

67、可以明顯可以降低死亡率，但是也容易產(chǎn)生耐藥性等問題，因此提前預(yù)防是控制該病的最有效的方法之一。目前雖然在一定程度上商品疫苗能有效降低豬群的發(fā)病率，但是對于慢性感染或者一些帶菌豬是不能進行預(yù)防的。在臨床上接種滅活疫苗雖然能防止該病的發(fā)生，但是也有可能失敗。因為商用滅活疫苗的最基本的要求具有交叉保護性，而由于副豬嗜血桿菌在不同地區(qū)具有不同的血清型，導(dǎo)致其缺乏相互交叉保護性，對其他有毒力血清型或菌株的交叉保護不是很明顯而喪失功效。</p

68、><p>　　本實驗通過在涂有細菌的平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關(guān)系。利用藥敏試驗對該豬場的副豬嗜血桿菌進行檢測，可以有效的篩選出對豬場的副豬嗜血桿菌敏感的藥物。</p><p

69、><b>　　3.1試驗材料</b></p><p>　　副豬嗜血桿菌：本實驗室分離所得（經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司測序）；</p><p>　　TSA平板（HB7026-9；青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p><p>　　TSB平板（HB7026-11；青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p>&l

70、t;p>　　乳酸諾氟沙星（70458967；武漢欣欣佳麗生物科技有限公司）；</p><p>　　頭孢噻呋（103980445；武漢欣欣佳麗生物科技有限公司）；</p><p>　　恩諾沙星（CFC003D；深圳市龍崗區(qū)平湖康利飼料貿(mào)易批發(fā)商行）；</p><p>　　多西環(huán)素（VO1158；鄭州振華醫(yī)藥科技服務(wù)有限公司）；</p><p&

71、gt;　　阿莫西林（26787780；武漢遠城科技有限公司南箭化工廠）；</p><p>　　大觀霉素（21736834；鄭州棟啟廣利生物科技有限公司）；</p><p>　　培氟沙星（47261379；西安萬昌生物科技有限公司）；</p><p>　　磺胺嘧啶鈉（22199082；鄭州東牧化工產(chǎn)品有限）；</p><p>　　電子分析天平（

72、FA1004A；成都市科恒達儀器設(shè)備有限公司）；</p><p>　　移液器（eppendorfresearchplus；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司）；</p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（RXZ-2000 C；寧波江南儀器制造廠）；</p><p>　　雙目生物顯微鏡（Nikon 80i；日本尼康公司）；</p><p>　　無菌接種箱（

73、WJ-J2X；濟南杰康凈化設(shè)備廠）；</p><p>　　冰箱（BCD-252KU；河南新飛電器有限公司）；</p><p>　　恒溫培養(yǎng)箱（HWS-250；寧波江南儀器制造廠）;</p><p>　　鼓風干燥箱（101-2；上海本杉儀器設(shè)備有限公司）;</p><p>　　純水機（TPD1-10UV2；菏澤開發(fā)區(qū)海大儀器設(shè)備有限公司）；&l

74、t;/p><p>　　酒精燈、涂布棒、手術(shù)鑷子。</p><p>　　3.1.1藥敏片制備</p><p>　　取潔凈的定性濾紙片，用打孔機打成直徑為6 mm的圓形紙片。每50片裝入一個干燥潔凈的小瓶中，單層牛皮紙包扎瓶口，高壓滅菌15-30 min后，放入37 ℃恒溫干燥箱中烘干備用。</p><p>　　3.1.2抗菌藥液的制備</p

75、><p>　　按商品藥的使用治療量的比例配制藥液，如某商品藥的說明治療量為0.01%飲水，即取1 mg藥品加入10 L的蒸餾水混合均勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。</p><p>　　3.1.3藥敏片的制備</p><p>　　在上述含有50片紙片的小瓶中加入制備好的藥液0.25 mL，并充分翻動紙片，使各紙片均勻浸透藥液，切勿在翻動紙片時將紙片搗爛。同時在瓶子

76、上添加標簽，記錄藥物名稱，放入37 ℃溫箱內(nèi)干燥16 h后即密蓋備用。</p><p>　　切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。</p><p><b>　　3.2試驗方法</b></p><p>　　將副豬嗜血桿菌分離株接到TSA 培養(yǎng)基中，在溫度為37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，挑菌落，接種于TSB 培養(yǎng)基。用麥氏比濁法[54]

77、，將菌液稀釋至濃度約為1.5×109cfu/mL。</p><p>　　在無菌操作臺中，將藥敏紙片依次編號，吸取稀釋后菌液100μL，接種于TSA平板中，用滅菌后的涂布棒將菌液均勻的涂布在平板中，晾2～5 min后，用無菌鑷子將藥敏片貼在相應(yīng)的標號位置并用鑷子輕輕按壓，使藥敏片貼緊培養(yǎng)基。每個培養(yǎng)基上貼3-5片藥敏片，以便每個藥敏片之間的距離足夠大，以免影響結(jié)果判定。</p><p&

78、gt;　　將平板置于溫度為37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后取出，觀察實驗結(jié)果。</p><p>　　藥敏實驗的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。藥物敏感實驗判定標準見表2。</p><p>　　表2藥物敏感實驗判定標準</p><p>　　注＜表示小于號，＞表示大于號</p><p>　　注意事項1.培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)副豬嗜血桿

79、菌的營養(yǎng)需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。</p><p>　　2.細菌接種量：副豬嗜血桿菌接種量應(yīng)適量，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。</p>&

80、lt;p>　　3.藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴格按照其推薦治療量配制。</p><p>　　4.培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時，使抗菌藥預(yù)擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈藥敏試驗。</p><p><b>

81、;　　3.3試驗結(jié)果</b></p><p>　　藥物敏感實驗后，應(yīng)選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。</p><p>　　用游標卡

82、尺測量抑菌圈的直徑，并記錄副豬嗜血桿菌藥敏試驗的結(jié)果，見表4。</p><p>　　表3 副豬嗜血桿菌藥敏試驗結(jié)果</p><p>　　注：抑菌直徑d≥20 mm為高度敏感；15 mm＜d＜20 mm為中度高敏；d≤15 mm為低敏感。</p><p>　　由表3 可知，乳酸諾氟沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、培氟沙星四種藥物的抑菌圈直徑較大，故該菌對這些藥物高度敏感，該

83、菌對大觀霉素中度敏感，頭孢噻呋、阿莫西林、磺胺嘧啶鈉三種藥物對細菌的抑菌圈較小，所以該菌對這三種藥物低度敏感。</p><p>　　3.3.1治療方案 </p><p>　　首先，對病豬進行隔離；其次，對患病豬采取以下治療方案：乳酸諾氟沙星肌肉注射，用量為1 mL/kg（體重），每日2-3次，連續(xù)使用3 d。若效果不理想，可換用多西環(huán)素肌肉注射，用量為1 mg/kg（體重），每日2-3 次

84、，連續(xù)使用3 d。用藥同時，可拌料飼喂多維，提高病豬的抵抗力。</p><p><b>　　3.3.2療效觀察</b></p><p>　　通過治療后得到豬的治療結(jié)果，與養(yǎng)殖場以往的療效進行比較，統(tǒng)計并計算病豬的治愈率，詳見表4。</p><p>　　表4 患病豬治療后效果</p><p>　　由表4可知，經(jīng)過該方案治療

85、，全程患病豬康復(fù)46頭，治愈率高達92％，高于該場以往的治愈率，治療效果明顯，有效控制了病情的蔓延，為豬場挽回了損失。</p><p><b>　　3.3.3預(yù)防方案</b></p><p>　　3.3.3.1環(huán)境管理</p><p>　　嚴格做好消毒工作，及時清理糞尿，保持好畜舍衛(wèi)生，注意四季通風換氣、保暖。由于副豬嗜血桿菌病有敗血癥特性，體

86、液免疫在免疫保護中起著主要保護性作用。免疫后備母豬即可提高母源抗體水平，又可減低仔豬全身感染的風險。一般選用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗Z-1517株，對需要免疫的豬只進行肌肉注射，無論大小注射量均為1頭份/每頭[55]。</p><p>　　3.3.3.2減少應(yīng)激</p><p>　　保證營養(yǎng)均衡，合理配合全價飼料，確保飼料品質(zhì)，換料時至少3-5 d過度；盡可能減少應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，如應(yīng)避免擁擠

87、、減少外界刺激、加強保暖和通風；定期驅(qū)蟲、保健、消毒、滅鼠，提高豬的抗病能力，減少該病的發(fā)生。</p><p>　　3.3.3.3藥物預(yù)防</p><p>　　在飼料中添加藥物也可以很好地預(yù)防本病，通常在母豬、乳豬、保育豬飼料中添加預(yù)防量藥物，如氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶等，每月一療程，每療程5-7 d。</p><p><b>　　3.4討 論</b

88、></p><p>　　3.4.1疾病治療方面的討論</p><p>　　由于抗菌藥物的長期不合理使用或反復(fù)使用一種或幾種抗生素藥物造成的耐藥菌株的不斷增多、耐藥性日益增強，導(dǎo)致傳統(tǒng)敏感藥物紅霉素、壯觀霉素等治療效果日趨不佳。因此，本試驗通過敏感藥物篩選，篩選出適合該豬場的治療用藥，對生產(chǎn)具有非常重要的意義。</p><p>　　本實驗研究表明，可能由于長期的

89、使用，副豬嗜血桿菌對頭孢噻呋、阿莫西林、磺胺嘧啶鈉等藥物敏感度較低，治療效果不佳，而對乳酸諾氟沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、培氟沙星藥物敏感度非常高，用其藥物治療后，效果顯著，疾病得到有效的控制。</p><p>　　3.4.2疾病預(yù)防方面的討論</p><p>　　當前，副豬嗜血桿菌病在海內(nèi)外普遍存在，而且豬群在發(fā)病后，時常與其他病毒病、細菌病混合感染。例如副豬嗜血桿菌病與藍耳、豬瘟等病毒性

90、疾病混合感染時，藥物治療的效果不佳，甚至毫無效果。因此，應(yīng)實施嚴格的環(huán)境控制與管理制度，加強飼養(yǎng)管理，施行疫苗防疫與藥物防治相結(jié)合的預(yù)防措施；為豬群提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境和優(yōu)質(zhì)的飼料，增強其仔豬的體質(zhì)和抗病力；優(yōu)化環(huán)境管理，保持畜舍通風換氣，干凈清潔，減少各種應(yīng)激；消除發(fā)病誘因，可最大限度的降低該病在駐馬店地區(qū)的發(fā)病率，對預(yù)防本病效果更佳。</p><p>　　第四章 副豬嗜血桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)</p>&

91、lt;p>　　副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的一種常在寄生菌，是豬格雷舍氏病(Glasser’s disease)的病原體。這種細菌在環(huán)境中廣泛存在，各個國家都存在這種病原，甚至是健康的豬群當中也能發(fā)現(xiàn)。隨著世界養(yǎng)豬行業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)?；s化養(yǎng)豬技術(shù)的應(yīng)用和飼養(yǎng)密度的增高，以及突發(fā)性新的呼吸道綜合征等因素存在，使得該病日益流行，危害越來越嚴重。</p><p>　　副豬嗜血桿菌一般僅感染豬，可以影響2周齡到16

92、周齡的青年豬，大多在保育階段發(fā)病，常見于5周齡到8周齡的豬，發(fā)病率大約在10 %-15 %，嚴重時病死率高達50 %[57-578]。疫苗對疾病預(yù)防的起著至關(guān)重要的作用，對預(yù)防副豬嗜血桿菌也起著重要影響，并配合相應(yīng)保健藥物能夠有效降低副豬嗜血桿菌的發(fā)病率。在疫苗制作過程中，副豬嗜血桿菌的快速大量繁殖是至為關(guān)鍵的一步。副豬嗜血桿菌在體外培養(yǎng)要求嚴格，快速生長繁殖受到一定的抑制，故本試驗通過在不同pH值、溫度、鈣磷濃度的大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基

93、(Trypticase Soy Broth，TSB)中培養(yǎng)，再平板計數(shù)篩選出適合其生長的最佳條件。</p><p>　　各血清型的流行情況因為各區(qū)域分布不同、環(huán)境氣候差異等原因，使其在各地分布有所不同，國內(nèi)研究結(jié)果表明，當前副豬嗜血桿菌優(yōu)勢血清型主要為Ⅳ、Ⅴ、Ⅻ、ⅩⅢ型[59]。本試驗選取副豬嗜血桿菌血清型Ⅴ進行優(yōu)化培養(yǎng)，為其大量快速繁殖提供基礎(chǔ)。</p><p>　　副豬嗜血桿菌在胰蛋白

94、胨固體培養(yǎng)基（Soybean-Casein Digest Agar Medium， TSA）上生長，菌落豐滿，培養(yǎng)時間較短。液體培養(yǎng)基胰蛋白胨和TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h均能到109 菌落數(shù)（Colony-Forming Units，CFU）,持續(xù)培養(yǎng)過程中,16 h左右時,每種培養(yǎng)基中的菌數(shù)量達到最大量, 16 h后細菌大量死亡, 但副豬嗜血桿菌在TSB 培養(yǎng)基中死亡速度較緩慢。因此TSB是副豬嗜血桿菌比較理想的培養(yǎng)基[60]。<

95、;/p><p>　　HSP對體外培養(yǎng)條件要求比較嚴格，無論是4 ℃冰箱保存，還是在培養(yǎng)過程中（對數(shù)生長后期）均會有大量細菌死亡，即使是數(shù)小時間隔，活菌數(shù)量也會有較大差異，因此細菌及實際數(shù)對副豬嗜血桿菌試驗研究尤為重要。利用菌液吸光值進行細菌即時計數(shù)是一種行之有效的方法，但應(yīng)在細菌培養(yǎng)18 h內(nèi)進行，否則對數(shù)生長后期死亡的細菌也可包括在計數(shù)中[61]。</p><p>　　為了篩選出最適合副豬嗜

96、血桿菌生長的液體環(huán)境,本試驗通過病菌的活化，在不同pH值、溫度、鈣磷濃度液體TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后倒平板數(shù)菌落確定細菌濃度，并進行方差分析篩選出最適合其生長的液體的條件。</p><p><b>　　4.1試驗材料</b></p><p><b>　　4.1.1試驗菌株</b></p><p>　　經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限

97、公司鑒定的副豬嗜血桿菌。</p><p><b>　　4.1.2試驗儀器</b></p><p>　　冰箱（BCD-252KU；河南新飛電器有限公司）；</p><p>　　恒溫培養(yǎng)箱（HWS-250；寧波江南儀器制造廠）；</p><p>　　無菌接種箱（WJ-J2X；濟南杰康凈化設(shè)備廠）；</p>&l

98、t;p>　　雙目生物顯微鏡（Nikon 80i；日本尼康公司）；</p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（RXZ-2000 C；寧波江南儀器制造廠）；</p><p>　　移液器（eppendorfresearchplus；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司）；</p><p>　　高速低溫離心機（Eppendorf5430R；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司）；</

99、p><p>　　真空冷凍干燥機(SHZ-D(III)；河南世佳儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司)；</p><p>　　智能不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZM-60KCS；河南瑞源化驗儀器有限公司)；</p><p>　　鼓風干燥箱（101-2；上海本杉儀器設(shè)備有限公司）；</p><p>　　酸度計（PHS-3C；西安匯鴻環(huán)?？萍加邢薰荆?lt;/p&

100、gt;<p><b>　　4.1.3試驗試劑</b></p><p>　　胰蛋白胨(73049737,北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)；</p><p>　　大豆蛋白胨(2014028,北京鼎豐基業(yè)生物科技發(fā)展有限公司)；</p><p>　　磷酸氫二鉀(20080829；濟南世紀通達化工有限公司)；</p><

101、;p>　　葡萄糖(20120512；江陰市通途商貿(mào)有限公司)；</p><p>　　氯化鈉(7647145；江陰市通途商貿(mào)有限公司)；</p><p>　　氯化鈣(10043524；天津市凱通化學試劑有限公司)；</p><p>　　瓊脂(20120416；上海醫(yī)學化驗所試劑廠)；</p><p>　　TSA平板（HB7026-9；青島

102、高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p><p>　　胰蛋白胨15.0 g,大豆蛋白胨5.0 g,氯化鈉5.0 g,葡萄糖2.5 g，瓊脂15 g, 滅菌蒸餾水1000 mL, pH 7.2-7.4。</p><p>　　TSB平板（HB7026-11；青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；</p><p>　　胰蛋白胨15.0 g ,大豆蛋白胨5.0 g ,

103、氯化鈉5.0 g ,葡萄糖2.5 g ,滅菌蒸餾水1000 mL, pH 7.2-7.4。</p><p>　　4.1.4培養(yǎng)基配制過程</p><p>　　(1) 稱量：用電子天平稱量培養(yǎng)基所需的各種藥品</p><p>　　(2) 溶化：先將稱好的藥品置于容量瓶中，再加入適量蒸餾水并用玻璃棒不斷攪動，加熱溶解。當配制TSA培養(yǎng)基時，將各成分加熱攪拌溶解。<

104、/p><p>　　(3) 定容：待藥品全部溶解后，加無菌水至所需體積。</p><p>　　(4) 調(diào)pH：用酸度計測定培養(yǎng)基的pH，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液進行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐滴添加NaOH或HCl溶液，邊加邊攪拌，直至達到所需pH為止。</p><p>　　(5) 過濾：用多層紗布過濾培養(yǎng)基并進行分裝。&l

105、t;/p><p>　　(6) 滅菌：在立式壓力蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。</p><p><b>　　4.2試驗方法</b></p><p>　　4.2.1 副豬嗜血桿菌的活化</p><p>　　左手拿瓊脂平板，使其與水平面成45º角；右手拿鉑金耳，使之與水平面平行，靠近酒精燈火焰操作。將接種環(huán)置于

106、酒精燈外焰中灼燒，滅菌，待其冷卻后，蘸取副豬嗜血桿菌菌種少許進行蛇形劃線。再將接種環(huán)燒灼滅菌，在皿底用蠟筆標記接種日期。以上過程均在滅菌過的超凈工作臺中操作。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)16 h觀察結(jié)果。</p><p>　　4.2.2不同pH值對副豬嗜血桿菌生長的影響</p><p>　　將TSB培養(yǎng)基分別將pH值調(diào)節(jié)至6.8、7.0、7.2、7.4、7.6。接種副豬嗜血桿菌，每個pH設(shè)

107、置三個平行實驗，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16 h。</p><p>　　4.2.3不同溫度對副豬嗜血桿菌生長的影響 </p><p>　　將副豬嗜血桿菌接種于TSB培養(yǎng)基中，將菌液分別放置35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃。接種副豬嗜血桿菌放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個溫度設(shè)置三個平行實驗，培養(yǎng)16 h。</p><p>　　4.2.4不同鈣

108、磷離子濃度對副豬嗜血桿菌生長的影響 </p><p>　　將TSB培養(yǎng)基添加氯化鈣使添加鈣離子濃度分別為0.002 %、0.02 %、0.04 %、0.06 %、0.08 %；同時添加磷酸氫二鉀使添加磷濃度分別為0.001 %、0.01 %、0.02 %、0.03 %、0.04 %。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個離子濃度設(shè)置三個平行實驗，培養(yǎng)16 h。</p><p>　　4.2.5副豬

109、嗜血桿菌計數(shù)方法</p><p>　　編號 取無菌平皿9套，分別標記為10-4、10-5、10-6各3套，另取6支無菌試管分別標記為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。</p><p>　　稀釋 用移液槍無菌吸取1 mL已充分混勻的副豬嗜血桿菌懸液，取0.5 mL至10-1的試管中，將多余的菌液放回原菌液中。將10-1試管充分振蕩、混勻。取10-1菌液1 mL，精確

110、地放0.5 mL至10-2試管中，依次類推。</p><p>　　取樣 用移液槍分別吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌懸液各1 mL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2 mL。</p><p>　　倒平板 將向上述盛有不同稀釋菌液的平皿中倒入滅菌后冷卻至45 ℃的TSA培養(yǎng)基約17mL，置水平位置迅速輕輕震蕩平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻并在皿底標記培養(yǎng)條件。</p&g