利用核糖核酸干擾技術(shù)獲得含高支持鏈淀粉且抗病毒的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)淀粉在食品及化工領(lǐng)域都有廣泛的應用價值,淀粉的糊化和凝沉特性是其應用的重要參考指標。支鏈淀粉具有易糊化、不易老化等特性,被廣泛應用于造紙業(yè)、紡織業(yè)和粘膠劑生產(chǎn)等領(lǐng)域;直鏈淀粉常被用作脂肪替代物。馬鈴薯病毒病是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害,尤其是馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)。目前,利用分子生物學方法調(diào)控作物淀粉合成過程中相關(guān)酶基因的表達以及沉默

2、病毒基因,從而降低淀粉糊化溫度與改善凝成性,實現(xiàn)植物抗病。本文利用RNA干擾技術(shù)通過調(diào)控馬鈴薯塊莖中顆粒結(jié)合性淀粉合成酶基因(Granule-bound starch synthase,GBSS)的表達,抑制直鏈淀粉的合成,同時干擾病毒外殼蛋白基因的表達,獲得了含高直鏈淀粉且抗病毒的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
   本文第一部分內(nèi)容是構(gòu)建含有一種或多種病毒外殼蛋白基因與GBSS基因片段的RNAi載體,并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯,獲得馬鈴薯轉(zhuǎn)

3、化株,通過PCR鑒定篩選陽性克隆,利用Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)基因植株GBSS表達量,獲得GBSS沉默效率達98.21%的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯,碘染色轉(zhuǎn)基因試管薯淀粉顆粒,GBSS沉默效率為98.21%的轉(zhuǎn)基因試管薯淀粉顆粒為紅褐色,非轉(zhuǎn)基因試管薯淀粉顆粒為藍色。選取GBSS沉默效率高于80%的轉(zhuǎn)基因植株4株、60%-75%的轉(zhuǎn)基因植株2株、低于50%的轉(zhuǎn)基因植株2株進行病毒接種,經(jīng)Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)基因植株中:PVY的積累量

4、,GBSS沉默效率為98.21%的轉(zhuǎn)基因植株抗PVY效率為100%,從而獲得了含高支鏈淀粉的抗病毒轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。
   本文第二部分內(nèi)容是通過刪除載體中的選擇標記基因,獲得了無選擇標記載體,分別構(gòu)建以GBSS基因啟動子驅(qū)動的GBSS基因中端反義序列,CaMV35S啟動子驅(qū)動的GBSS基因中端反向重復序列的兩種無篩選標記載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株,共獲得了455株馬鈴薯轉(zhuǎn)化株,經(jīng)PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)基因植株1株,通過Real-

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