利用轉(zhuǎn)基因技術研究肌抑素基因?qū)﹄u骨骼肌發(fā)育的影響.pdf

1、肌抑素（myostatin，又名GDF-8），為轉(zhuǎn)化生長因子-beta（TGF-β）超家族成員之一，其功能是負向調(diào)控骨骼肌的生長和發(fā)育。隨著研究的深入myostatin基因的一些新功能被逐漸發(fā)現(xiàn)，其在肌肉的發(fā)生、生長發(fā)育、再生、萎縮和退化等過程中均扮演著重要角色，日益顯現(xiàn)出該基因在功能上的重要性。為進一步研究myostatin基因在胚胎發(fā)生和體內(nèi)骨骼肌發(fā)育中的功能作用和機制，本研究以雞為研究對象，分別在體外和體內(nèi)對myostatin進行

2、了功能研究和結(jié)構(gòu)分析，獲得了較好的實驗結(jié)果。具體過程如下：
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒介導法建立轉(zhuǎn)基因雞技術平臺：即將標記基因（增強型綠色熒光蛋白，EGFP）克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，以phoenix或HEK293T細胞進行泛嗜性VSV-G（水泡性口炎病毒囊膜蛋白）病毒包裝，并用包裝病毒體外侵染原代雞胚胎成肌細胞（Chicken Embryonic Myoblasts，CEM）檢測病毒侵染效率、整合及轉(zhuǎn)錄活性，然后大量包裝病毒并超離濃縮后，將

3、濃縮病毒進行新生種蛋胚盤下腔接種，分別對接毒5天發(fā)育全胚和新生雛雞的不同臟器進行基因組PCR鑒定分析。結(jié)果表明：包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有侵染和轉(zhuǎn)錄活性；體內(nèi)鑒定分析顯示標記基因EGFP已整合到5天雞胚和一只雛雞的胸腺和皮膚組織基因組中，表明制備嵌合型GFP轉(zhuǎn)基因雞的技術平臺基本建立。
　　Myostatin基因在雞胚胎發(fā)育早期的功能初探：即針對雞myostatin基因編碼序列設計四條靶片段（19bp），并將其克隆到RNAi逆轉(zhuǎn)錄

4、病毒表達載體pSIREN-RetroQ中，體外分析表明RNAi能封閉靶基因myostatin的轉(zhuǎn)錄活性。利用轉(zhuǎn)基因雞技術平臺，大量包裝泛嗜性RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒，將濃縮病毒進行新生種蛋胚盤下腔接種，回收5天接毒發(fā)育雞胚進行全胚半定量分析。結(jié)果表明：重組RNAi病毒能夠下調(diào)5天胚胎myostatin的表達，并誘導MyoD和myogenin兩基因表達明顯上調(diào)，P21表達下調(diào)，促進myostatin下調(diào)組織部位的肌肉發(fā)生。另原位雜交分析表明：m

5、yostatin在胚胎不同組織部位表達量存在差異，在腦和眼等部位高表達，說明myostatin在雞胚胎早期發(fā)育中可能還具有其他重要作用。
　　Myostatin基因在雛雞胸肌發(fā)育中的功能初探：將包裝濃縮后的RNAi病毒和RNAi重組質(zhì)粒分別梯度接種0天雛雞的胸肌，并以PBS接種組雛雞為對照，飼養(yǎng)10天后宰殺雛雞觀察胸肌表型變化，提取各組雛雞胸肌組織RNA和蛋白進行分析。結(jié)果表明：胸肌接種myostatin的RNAi重組病毒或質(zhì)粒后

6、，能夠封閉靶基因myostatin的表達，誘導MyoD、myogenin、Pax7和mIGF-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和P21下調(diào)。RNAi接種組雛雞表現(xiàn)出胸肌豐滿肥厚，肌纖維肥大，肌纖維內(nèi)細胞核增多。
　　雞myostatin基因啟動子活性分析：為深入理解myostatin基因的表達調(diào)控機制，本實驗克隆了肉雞和蛋雞5'端調(diào)控區(qū)2.0kb片段，序列分析表明不同種屬動物myostatin基因啟動子間保守性較高，而且在肉雞和蛋雞myostat

7、in基因啟動子區(qū)域也保守地存在著多個CAAT盒和E盒。此外，在其他種屬動物如牛、豬、羊等myostatin基因啟動子上的一些肌肉生長反應元件在肉雞和蛋雞中也同樣保守存在。根據(jù)肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間的SNP位點的不同，設計了肉雞和蛋雞六個不同長度的啟動子片段并克隆到pGL3-Basic載體中，將重組載體分別轉(zhuǎn)染和相互轉(zhuǎn)染肉雞和蛋雞胚胎成肌細胞（CEM），通過Luciferase Assay System和β-Galact

8、osidase Enzyme Assay System兩檢測系統(tǒng)相結(jié)合，利用缺失分析的方法來比較肉雞和蛋雞啟動子活性及差異。結(jié)果表明：肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間轉(zhuǎn)錄活性存在差異，其中肉雞和蛋雞在0.2kb片段處活性差異較大。肉雞和蛋雞啟動子在各自細胞中活性均較高，但相比較而言蛋雞細胞環(huán)境更適于myostatin基因的轉(zhuǎn)錄。突變分析表明：0.2kb片段的-19bpSNP位點為該片段在肉雞和蛋雞間活性差異的關鍵位點?？傊怆u

9、和蛋雞myostatin基因啟動子間確實存在轉(zhuǎn)錄活性差異，而這種轉(zhuǎn)錄活性差異與肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間的SNP位點的存在和肉雞和蛋雞不同的細胞內(nèi)環(huán)境有關。
　　通過以上分析表明：轉(zhuǎn)基因雞技術平臺與RNAi技術相結(jié)合的方法來研究myostatin在雞胚胎發(fā)育早期的作用和出生后骨骼肌增生中功能取得了較好效果，結(jié)果表明myostatin不但在雞胚胎發(fā)育早期顯著影響著肌肉發(fā)生和相關基因的表達變化，而且可能具有除參與肌肉發(fā)生