Bt毒素對(duì)稻飛虱安全性評(píng)價(jià)和活性菌株篩選.pdf

1、稻飛虱是水稻上最主要的害蟲之一，主要包括褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱，給水稻的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt）產(chǎn)品以其高效安全、對(duì)目標(biāo)害蟲的特異性而倍受親睞，并逐漸成為研究最深入、應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑。目前關(guān)于Bt防治害蟲的研究主要集中在鱗翅目、鞘翅目等防治效果顯著的害蟲中，帶來(lái)了很好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，但尚未見(jiàn)到對(duì)稻飛虱有毒力菌株的報(bào)道。
　　 為了實(shí)現(xiàn)用Bt類產(chǎn)品防治稻

2、飛虱，開(kāi)發(fā)利用對(duì)稻飛虱有特效的Bt制劑，本文首先建立了測(cè)定殺蟲化合物對(duì)稻飛虱潛在影響的Tier-1毒性測(cè)定模型，并用該模型對(duì)已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入水稻的Bt毒素對(duì)非靶標(biāo)害蟲稻飛虱進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，以預(yù)測(cè)稻飛虱在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻田間發(fā)生與為害的可能趨勢(shì)。Bt毒素與害蟲中腸BBMV上的受體結(jié)合是毒素發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵步驟，因此本文對(duì)稻飛虱可能的Bt受體堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，簡(jiǎn)稱ALP)從生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面進(jìn)行初步研

3、究，克隆到兩條ALP的基因并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定;最后對(duì)大量標(biāo)準(zhǔn)的Bt菌株進(jìn)行室內(nèi)生物測(cè)定，篩選對(duì)稻飛虱有活性及特異性菌株，為后續(xù)發(fā)展轉(zhuǎn)Bt基因水稻防治稻飛虱提供理論基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)對(duì)以上內(nèi)容的研究，得出了以下幾點(diǎn)結(jié)論:
　　 一、Bt毒素對(duì)非靶標(biāo)害蟲稻飛虱的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)
　　 首先選用合適的人工飼料發(fā)展了一套評(píng)價(jià)純殺蟲蛋白對(duì)灰飛虱潛在影響的毒性測(cè)定模型，用E-64和PA作為模式化合物驗(yàn)證所建立的Tier-1試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?/p>

4、靈敏性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的Tier-1毒性測(cè)定模型具有較高的靈敏度。借助此模型就Cry2Aa殺蟲蛋白對(duì)灰飛虱生存率、若蟲發(fā)育歷期和初羽化成蟲鮮重的影響作較系統(tǒng)研究，結(jié)果表明Cry2Aa對(duì)灰飛虱無(wú)毒性影響。另外，試驗(yàn)中還通過(guò)ELISA和靶標(biāo)昆蟲生測(cè)技術(shù)全程監(jiān)測(cè)殺蟲化合物的濃度、穩(wěn)定性及生物活性。
　　 二、兩種堿性磷酸酯酶的生化及分子生物學(xué)初步研究
　　 本文克隆和測(cè)定酶活性均以褐飛虱的整個(gè)蟲體做為研究對(duì)象，采用超

5、速離心的方式分離純化了可溶性和膜結(jié)合兩種堿性磷酸酯酶，在最佳pH環(huán)境下測(cè)定兩種堿性磷酸酯酶的酶活性;并采用簡(jiǎn)并引物PCR和RACE技術(shù)克隆了褐飛虱兩種堿性磷酸酯酶的全長(zhǎng)基因，這是在半翅目昆蟲中率先鑒定出來(lái)的堿性磷酸酯酶基因。它們與其它昆蟲的堿性磷酸酯酶序列都具有40％-50％的相似性，序列比對(duì)分析顯示兩種堿性磷酸酯酶都存在一個(gè)假定的堿性磷酸酯酶的信號(hào)區(qū)域和13個(gè)重要功能氨基酸。此外，N1-ALP2包含一個(gè)假定的GPI錨定的位點(diǎn)，而N1-

6、ALP1沒(méi)有該位點(diǎn)。并通過(guò)WesternBlotting實(shí)驗(yàn)直接證明這兩個(gè)基因分別編碼可溶性的和膜結(jié)合的堿性磷酸酯酶，因此將兩個(gè)基因分別命名為N1-sALP和N1-mALP。
　　 三、對(duì)稻飛虱有活性的Bt菌株的篩選
　　 本文利用人工飼料對(duì)灰飛虱進(jìn)行大量Bt菌株篩選，利用該方法對(duì)68株標(biāo)準(zhǔn)的Bt菌株進(jìn)行活性篩選，結(jié)果篩選到1株其晶體蛋白和可溶性小分子均對(duì)灰飛虱有較高毒性的Bt菌株T42001，且對(duì)其進(jìn)一步分離純化后得到