黃顙魚潰瘍綜合征病原菌及主要毒力因子研究.pdf

1、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco，Yellowcatfish)屬鯰形目，鲿科，黃顙魚屬。廣泛分布于我國(guó)的長(zhǎng)江、珠江、黑龍江流域及太平洋水系，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，也是我國(guó)出口創(chuàng)匯的優(yōu)良魚種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值超過四大家魚。在我國(guó)，黃顙魚已人工馴化飼養(yǎng)，年產(chǎn)量已達(dá)50萬噸左右，產(chǎn)值超過10億元/年。由于養(yǎng)殖模式的變化和規(guī)模不斷擴(kuò)大，新的傳染疾病出現(xiàn)了暴發(fā)與流行。近年來，重慶市一些集約化魚場(chǎng)養(yǎng)殖的黃顙魚出現(xiàn)鰭紅腫、出血，肌肉潰

2、瘍及敗血癥的疾病，發(fā)病率超過30％，死亡率高達(dá)15％，經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重危及養(yǎng)魚業(yè)的生存與發(fā)展。但是，該傳染病的病原尚不清楚，故不能有效地進(jìn)行預(yù)防和治療。確定其病原及致病機(jī)理，可為有效預(yù)防和治療黃顙魚的潰瘍綜合征提供臨床依據(jù)，對(duì)于黃顙魚養(yǎng)殖有重要的理論和生產(chǎn)意義。
　　 目前，有關(guān)黃顙魚潰瘍綜合征的病原尚不清楚，其致病機(jī)理也待研究。由于魚類潰瘍綜合征的病原細(xì)菌有10余種，必須明確黃顙魚潰瘍綜合征病原，弄清其發(fā)病機(jī)理，才能有效控制

3、黃顙魚潰瘍綜合征。本研究從患病黃顙魚分離獲得病原，借助細(xì)菌生化及分子鑒定方法確定病原種類，對(duì)溶血素、氣溶素、胞外絲氨酸蛋白、脂肪酶重要毒力因子的基因進(jìn)行了克隆，并通過大腸桿菌異源表達(dá)獲得了重組溶血素，為利用重組溶血素蛋白作為抗原，建立檢測(cè)溫和氣單胞菌技術(shù)及亞單位疫苗研制提供了基礎(chǔ)條件。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.病原分離鑒定與致病性
　　 從黃顙魚病料的心血獲得兩株細(xì)菌，命名為RC-07-KA株和RC-07-XB株。兩

4、株細(xì)菌能夠在LB、麥康凱、鮮血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。生化試驗(yàn)鑒定兩株細(xì)菌的氧化酶試驗(yàn)、精氨酸試驗(yàn)陽性、O/F發(fā)酵，KCN生長(zhǎng)試驗(yàn)、七葉苷、水楊苷等試驗(yàn)為陰性與溫和氣單胞菌(A.sobria)生化特性一致；通過PCR擴(kuò)增的16SrRNA基因序列與GenBank上公布的25株細(xì)菌16SrRNA的基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，本次分離菌株與6株不同來源的溫和氣單胞菌(A.sobria)EU916710、DQ822702、DQ822759(Lith

5、uania，2008)，AY987762(India，2006)，DQ133178(Korea，2007)，EU069415(China，2007)之間的親緣關(guān)系很近，同源性達(dá)到96.4-99.8％。結(jié)合兩種鑒定方法結(jié)果，證明分離的RC-07-KA株和RC-07-XB株為溫和氣單胞菌(A.sobria)。
　　 RC-07-KA株回歸動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，RC-07-KA株對(duì)試驗(yàn)的黃顙魚、鯉魚、鯽魚肌肉接種6.15×107CFU/尾

6、，七天內(nèi)能夠?qū)е滤劳?。鯽魚病理組織觀察表明，腎臟腎小球腫大，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，有的管腔內(nèi)可見絲狀纖維蛋白滲出，腎小管間質(zhì)中可見炎性白細(xì)胞浸潤(rùn)；心臟部分心肌纖維腫脹，橫紋不明顯；肝臟肝細(xì)胞變性壞死，排列紊亂，中央靜脈有纖維蛋白滲出，嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)；腸道粘膜部分上皮脫落，腸內(nèi)有大量中性白細(xì)胞和少量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等病變。表明RC-07-KA株對(duì)鯽魚多器官有明顯病理損傷。
　　 RC-07-KA株經(jīng)LB液

7、體培養(yǎng)基培養(yǎng)，過濾的無菌濾液，在10％鮮血LB瓊脂平板上進(jìn)行溶血活性初步測(cè)定，結(jié)果顯示：無菌濾液的溶血效價(jià)達(dá)到1x25，表明RC-07-KA株具有較強(qiáng)產(chǎn)生β溶血素特性；無菌濾液經(jīng)硫酸銨二步鹽析法處理得到胞外粗提物。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示：胞外粗提物有明顯的溶血性，表明具有溶血活性的β溶血素可以通過硫酸銨鹽析方法制備。
　　 2.RC-07-KA株主要毒力基因的克隆及序列分析
　　 溫和氣單胞菌的致病力與多種毒力因子相關(guān)，包括氣

8、溶素、溶血素、蛋白酶、脂肪酶等，為了探討RC-07-KA株的毒力因子，本試驗(yàn)采用PCR方法，擴(kuò)增、克隆了該菌株的溶血素、氣溶素、脂肪酶和胞外絲氨酸蛋白酶基因，并對(duì)其基因序列進(jìn)行了分析。
　　 2.1氣溶素基因
　　 通過PCR擴(kuò)增得到RC-07-KA株氣溶素基因0.7kb片段，克隆到pGEM-T載體，測(cè)序結(jié)果顯示，所得到的基因片段大小為692bp，序列能編碼230個(gè)氨基酸殘基的多肽。Blast分析結(jié)果顯示：得到的序列與氣

9、單胞菌屬內(nèi)菌株的氣溶素基因相關(guān)，屬于氣單胞菌屬的毒力因子氣溶素超家族(aerolysinsuperfamily)，序列含有成孔毒素的保守結(jié)構(gòu)域序列；遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示：RC-07-KA株氣溶素基因序列與中國(guó)、日本和印度等報(bào)道菌株A.hydrophila，AEF(HM853019，China，2010)，A.sobria，isolateS2-As(AF443392，China，2001)，A.sobriaisolateS34-As(AF

10、443394，China，2001)，A.veronii，S43-Av(AF443395，China，2001)，A.veroniiBv.sobria(AB109093，Japan，2004)，A.veronii，MTCC32497(EF034117，India，2007)的氣溶素基因序列親緣關(guān)系較近，為同一分支簇。分析結(jié)果同時(shí)顯示：中國(guó)來源的氣單胞菌分離株氣溶素基因分別屬于幾個(gè)主要的簇。
　　 2.2β溶血素基因
　　

11、 通過序列比對(duì)分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法擴(kuò)增得到RC-07-KA株β溶血素基因片段，克隆測(cè)序結(jié)果表明：得到的β溶血素基因片段大小為1467bp，包含一個(gè)ORF，編碼487個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白分子量約為54KDa。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，該基因與氣單胞菌屬中的A.hydrophila菌株Sb(AY611033)、NLEPA-1607(AF410466)、AEF(HM853019)，A.sobria菌株357(AY157998)、人源

12、分離株(EF620533)和A.salmonicida菌株17-2(X65048)的β溶血素基因親緣關(guān)系較近，同源性大于95％，而與其他菌株的同源性較低。進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示：氣單胞菌屬的β溶血素基因可分為幾個(gè)明顯分支的基因簇，RC-07-KA株溶血素基因與AY611033(A.hydrophilastrainSb)、EF620533(host="Homosapiens")、AY157998(A.sobriastrain357)、X650

13、48(A.salmonicidastrain：17-2)、AF410466(A.hydrophilastrain：NLEPA-1607)、HM853019(A.hydrophilastrainAEF)為同一簇。
　　 對(duì)比分析氣單胞菌屬內(nèi)與RC-07-KA株親緣關(guān)系較近及較遠(yuǎn)的代表菌株β溶血素氨基酸序列的親水性、抗原性指數(shù)及表面可及性，結(jié)果顯示：氣單胞菌屬的溶血素具有很強(qiáng)的抗原性，與RC-07-KA株親緣關(guān)系較近菌株β溶血素的抗

14、原性相差較小，揭示β溶血素具有作為候選的蛋白疫苗的潛能。
　　 2.3胞外絲氨酸蛋白酶基因
　　 采用PCR方法擴(kuò)增得到RC-07-KA株胞外絲氨酸蛋白酶基因得到1.9kb基因片段，克隆測(cè)序結(jié)果顯示：得到的RC-07-KA株胞外絲氨酸蛋白酶基因大小為1875bp，包含一個(gè)ORF，編碼624個(gè)氨基酸殘基的多肽。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：RC-07-KA株胞外絲氨酸蛋白酶基因與AF253471(A.sobriastrain

15、288)、AF126213(A.hydrophila，SouthKorea，1999)和CP002607(A.veroniiB565)屬于同一遺傳衍化分支Ⅱ。序列相似性分析結(jié)果顯示：RC-07-KA株胞外絲氨酸蛋白酶基因與AF253471、AF126213和CP002607的序列相似性高，分別為93.6％、93.3％和92.5％。這些結(jié)果表明我們成功克隆得到RC-07-KA株胞外絲氨酸蛋白酶基因，為進(jìn)一步深入研究胞外絲氨酸蛋白酶的功能奠

16、定了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.4脂肪酶基因
　　 采用PCR方法擴(kuò)增得到RC-07-KA株脂肪酶基因片段，克隆測(cè)序顯示：得到的脂肪酶基因片段為2445bp，包含一個(gè)ORF，編碼814個(gè)氨基酸殘基的多肽，蛋白分子量約為83KDa。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：RC-07-KA株脂肪酶基因與A.sobriastrainAS228(AB206038，Japan，2005)、A.sobriastrainAS008(AB206037，

17、Japan，2005)、A.sobriastrain288(JN019936，Japan，2011)屬于同一遺傳衍化分支Ⅱ。同源性分析結(jié)果顯示：RC-07-KA株脂肪酶基因與A.sobriaAS228、AS008(AB206038、AB206037，Japan，2005)的序列相似性高，分別為93.6％、93.3％。
　　 3.重組溶血素表達(dá)載體構(gòu)建
　　 將RC-07-KA株溶血素基因片段連接到pET28a，(+)載體

18、的EcoRⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、XhoⅠ、SalⅠ進(jìn)行單、雙酶切鑒定，結(jié)果表明：正確構(gòu)建得到重組溶血素表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Hly。將pET28a-Hly轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，用IPTG誘導(dǎo)溶血素基因的表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示：重組菌株表達(dá)目的蛋白條帶位于66.4KDa與44.3KDa之間，結(jié)果與預(yù)期相符，且重組蛋白多為包涵體，少量為可溶性蛋白。通過His單克隆抗體進(jìn)行Western-blot

19、鑒定，結(jié)果顯示在66.4KDa與44.3KDa之間出現(xiàn)印跡條帶，表明目的蛋白在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，這為進(jìn)一步研究重組溶血素的活性奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.重組溶血素優(yōu)化表達(dá)、純化及活性檢測(cè)
　　 為了得到較多的可溶性重組溶血素，對(duì)IPTG、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示：IPTG濃度為0.4mmol/L誘導(dǎo)溫度為32℃、誘導(dǎo)表達(dá)3-4h可溶目的蛋白的相對(duì)含量較高。在優(yōu)化的條件下表達(dá)可溶性溶血素，用Ni2+-S