黃牛、犏牛Piwi通路相關(guān)基因以及睪丸組織基因組甲基化分析.pdf

1、牦牛的遺傳改良在我國(guó)具有悠久的歷史，最早可追溯到1000多年前，藏族人民利用種間雜交來(lái)進(jìn)行改良，以提高后代乳肉生產(chǎn)性能。上世紀(jì)90年代初，我國(guó)開(kāi)始嘗試用一代黃改公牛改良牦牛，即“新三元雜交”，該方法操作簡(jiǎn)便、改良效果好、成本低、雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，但是F1代犏牛雄性不育，這成為牦牛遺傳改良的一大難題。本研究以健康成年黃牛、牦牛和犏牛為研究對(duì)象，利用PCR擴(kuò)增的方法獲取了黃牛以及牦牛Piwi蛋白家族Piwil1、Piwil2編碼區(qū)的基因序列。利用

2、熒光定量PCR的方法檢測(cè)了Piwil1、Piwil2基因在黃牛及犏牛睪丸組織中的表達(dá)差異，利用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法檢測(cè)了這兩個(gè)基因5'調(diào)控區(qū)甲基化狀態(tài)，再結(jié)合轉(zhuǎn)座子Line-1的表達(dá)水平以及DNA甲基化狀況，來(lái)探討Piwi蛋白參與的Piwi通路與犏牛雄性不育的關(guān)系.最后，利用甲基化芯片的方法檢測(cè)了黃牛以及犏牛基因組DNA的甲基化狀況，為研究犏牛雄性不育與DNA甲基化的關(guān)系提供理論依據(jù)。
　　 1.黃牛、牦牛Piwil1、Piwi

3、l2基因分子克隆、序列分析以及在黃牛和犏牛中mRNA表達(dá)、甲基化差異分析
　　 本實(shí)驗(yàn)以黃牛和牦牛睪丸組織總RNA為模板，分別用所設(shè)計(jì)的3對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)Piwil1以及Piwil2基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后通過(guò)ContigExpress軟件進(jìn)行序列拼接，獲得了黃牛和牦牛Piwil1、Piwil2基因完整的編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度各為2586bp和2910 bp，分別編碼861和969個(gè)氨基酸。Piwil1蛋白和Piwil2蛋白在氨基

4、酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有保守性，均含有PAZ和PIWI這兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中PAZ結(jié)構(gòu)域具有與核苷酸相結(jié)合的功能;PIWI結(jié)構(gòu)域又包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是與RNA的5'端定位相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是含有RNA酶切活性的DDH(Asp-Asp-His)結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域表明Piwil1和Piwil2蛋白的功能與RNA有密切的關(guān)聯(lián).
　　 以黃牛肌肉、血液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、卵巢、附睪、睪丸組織總RNA為模板，利用

5、設(shè)計(jì)的Piwil1、Piwil2和β-actin基因的定量引物對(duì)黃牛Piwil1、Piwil2基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明Piwil1、Piwil2基因在睪丸組織中特異表達(dá)，
　　 用Real-time PCR法對(duì)黃牛和犏牛睪丸組織Piwil1、Piwil2和β-actin基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Piwil1和Piwil2基因在黃牛睪丸組織中的表達(dá)量均極顯著高于犏牛睪丸組織中的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 在Pi

6、wil1以及Piwil2基因5'端側(cè)翼的CpG島區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)BSP引物，以亞硫酸氫鈉處理后的黃牛、犏牛睪丸組織基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)Piwil1的BSP擴(kuò)增產(chǎn)物包含26個(gè)CpG位點(diǎn)，覆蓋ADR1、HSF、cap、NF-E2等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位.甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，在被檢測(cè)的Piwil1基因CpG位點(diǎn)中，黃牛睪丸組織中甲基化的CpG位點(diǎn)占26.60％，犏牛的為91.20％，犏牛的甲基化水平極顯著高于黃牛(P＜0.01).P

7、iwil2的BSP擴(kuò)增產(chǎn)物包含19個(gè)CpG位點(diǎn)，覆蓋Nkx-2、cap、GCR1、MZF1、HSF、ADR1、MyoD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位.在被檢測(cè)的Piwil2基因CpG位點(diǎn)中，黃牛睪丸甲基化的CpG位點(diǎn)占59.50％，犏牛為95.80％，犏牛的甲基化水平極顯著高于黃牛(P＜0.01)。說(shuō)明Piwil1、Piwil2基因5'側(cè)翼的甲基化狀態(tài)發(fā)生變化分別對(duì)Piwil1、Piwil2基因的表達(dá)起調(diào)控作用，可能與犏牛精子發(fā)生障礙、雄性不育有關(guān)

8、。
　　 2.犏牛Line-1轉(zhuǎn)座子基因分子克隆、序列分析以及在黃牛和犏牛中mRNA表達(dá)、甲基化差異分析
　　 本實(shí)驗(yàn)以犏牛睪丸組織總RNA為模板，利用ORF1、ORF2擴(kuò)增引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，測(cè)序后用ContigExpress軟件進(jìn)行序列拼接，獲得了一段5221 bp的犏牛Line-1轉(zhuǎn)座子基因序列，包括部分的5'和3'端序列以及完整的ORF1和ORF2序列。ORF1蛋白編碼308個(gè)氨基酸殘基，為一個(gè)典型的轉(zhuǎn)

9、座元件成份，不合有特殊的結(jié)構(gòu)域，具有核苷酸綁定的功能;ORF2蛋白編碼1272個(gè)氨基酸殘基，含有L1-EN和RT_like這兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域.其中，L1-EN結(jié)構(gòu)域包含228個(gè)氨基酸殘基，從第9位氨基酸到第236位，具有核酸內(nèi)切酶的功能，RT_like結(jié)構(gòu)域共有263個(gè)氨基酸殘基，位于510位到772位氨基酸之間，具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的功能。這說(shuō)明Line-1轉(zhuǎn)座子在犏牛睪丸組織當(dāng)中具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的活性。
　　 對(duì)黃牛和犏牛睪丸組織β

10、-actin和Line-1基因mRNA表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，犏牛Line-1轉(zhuǎn)座子的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃牛睪丸組織中的表達(dá)量(P＜0.05)。這表明Line-1轉(zhuǎn)座子沉默機(jī)制在犏牛當(dāng)中發(fā)生異常，L1轉(zhuǎn)座子表達(dá)不受抑制，這可能F1代犏牛雄性不育有關(guān)。
　　 在Line-1基因的內(nèi)部啟動(dòng)子下游的CpG島內(nèi)設(shè)計(jì)BSP引物，以亞硫酸氫鈉處理后的黃牛、犏牛睪丸組織基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。BSP擴(kuò)增產(chǎn)物均為310bp，包含18個(gè)CpG

11、位點(diǎn)，覆蓋GATA-1、cap、E2F、MZF1、HSF、ADR1、MyoD等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，在被檢測(cè)的Line-1基因CpG位點(diǎn)中，黃牛睪丸甲基化的占84.40％，犏牛的為90.00％，兩者的甲基化水平無(wú)顯著差異(P＞0.05)。說(shuō)明L1轉(zhuǎn)座子的去阻遏并不是由于去甲基化造成的，而是在其他的調(diào)控途徑中出現(xiàn)了問(wèn)題，結(jié)合上一章，推測(cè)轉(zhuǎn)座子的高表達(dá)與Piwil1以及Piwil2基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　 3.

12、黃牛、犏牛基因組甲基化芯片分析
　　 本實(shí)驗(yàn)利用6頭黃牛、6頭犏牛的睪丸組織DNA進(jìn)行甲基化芯片分析，發(fā)現(xiàn)在黃牛以及犏牛睪丸組織中發(fā)現(xiàn)了17006個(gè)甲基化區(qū)域，其中黃牛甲基化區(qū)域?yàn)?428個(gè)占49.56％，犏牛甲基化區(qū)域?yàn)?578個(gè)占50.44％，甲基化差異區(qū)域有969個(gè)，這說(shuō)明黃牛與犏?；蚪M整體水平上甲基化差異不顯著，但是部分基因之間存在較大的差異。甲基化差異基因涉及多種生物學(xué)途徑以及信號(hào)通路，其中與精子發(fā)生關(guān)系較為密切的有