新城疫病毒TS09-2株全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建及熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)為副粘病毒科副粘病毒屬成員，其引起的新城疫(Newcastle Disease，ND)是一種高傳染性高破壞性的疾病，被國(guó)際獸醫(yī)局認(rèn)定為兩種A類(lèi)禽病之一。當(dāng)前，新城疫的防控以免疫預(yù)防為主，以NDV V4耐熱株為代表的耐熱活疫苗具有耐熱、冷鏈要求低、使用方便、毒力低、免疫效果好和可同居感染等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)及其他發(fā)展中國(guó)家有著廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)已有的NDV耐熱毒株有V4、I-2

2、、HB92、B95和TS09等，其中TS09株是我課題組經(jīng)過(guò)對(duì)V4株的雞胚耐熱選育、純化獲得的。如能夠采用反向遺傳操作技術(shù)將NDV耐熱毒株改造為耐熱載體，插入其他禽類(lèi)疫病的主要免疫源性基因，研發(fā)出禽類(lèi)主要疫病的多聯(lián)(多價(jià))耐熱活疫苗，將對(duì)禽病的防控帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。但是，關(guān)于NDV耐熱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的成功構(gòu)建至今仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以TS09耐熱株為研究對(duì)象，開(kāi)展了NDV耐熱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建工作。
　　 一、新

3、城疫病毒耐熱株的細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)
　　 現(xiàn)有的反向遺傳操作系統(tǒng)大多是在細(xì)胞上建立的，而TS09株為雞胚適應(yīng)株，不能在細(xì)胞上高效增殖。首先開(kāi)展了TS09株的BHK細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)及純化工作。細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果表明，0.2μg/mL的TPCK胰酶濃度為最大無(wú)毒濃度。連續(xù)17代傳代培養(yǎng)及3次極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應(yīng)BHK細(xì)胞的NDV耐熱株，命名為T(mén)S09-C株。TS09-C株的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：TS09-C株的

4、EID50值由原有的108.6/mL下降至105.7/mL，但TCID50值由原有的103.3/mL上升至107.9/mL，表明TS09-C株為細(xì)胞適應(yīng)毒，且保持了親本株的弱毒和耐熱的特性，成功選育了新城疫耐熱株細(xì)胞適應(yīng)毒株。此外，序列分析結(jié)果表明：TS09、TS09-C和V4株仍保持著較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系。
　　 二、TS09-C株的全基因組序列測(cè)定與分析
　　 設(shè)計(jì)了10對(duì)PCR引物對(duì)TS09-C株的全基因組進(jìn)行了序列

5、測(cè)定與分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列拼接后獲得TS09-C全基因組序列，全長(zhǎng)15186nt。序列分析表明TS09-C和I-2、I-2progenitor、Ulster-67共處在I型分支上，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(NP、P、M、F、HN和L)和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(V和W)；通過(guò)比對(duì)TS09-C株和V4株各基因的氨基酸同源性，發(fā)現(xiàn)M基因的同源性最低，為92.3%；F和HN的同源性較高，均大于99%。HN蛋白糖基化位點(diǎn)分析表明，TS09-C株HN蛋白僅含有4個(gè)

6、糖基化位點(diǎn)，缺失119位和508位糖基化位點(diǎn)。
　　 采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)TS09-C株的耐熱機(jī)理進(jìn)行了初步探討。比較包括TS09-C株在內(nèi)的4株耐熱株和非耐熱株氨基酸序列時(shí)，共發(fā)現(xiàn)23個(gè)耐熱株特有的氨基酸差異，其中大部分為保守性突變，非保守性突變僅發(fā)現(xiàn)在P和W蛋白上。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比較分析表明耐熱株和非耐熱株的二級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異主要在HN蛋白的α螺旋區(qū)。這些耐熱株特有位點(diǎn)(或結(jié)構(gòu))的發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步研究其耐熱提供了思路。

7、　　 三、TS09-C株全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建
　　 參考已經(jīng)獲得的TS09-C株全基因組序列，并進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)出了TS09-C株全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建策略。共設(shè)計(jì)了8對(duì)引物用于全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建。通過(guò)高保真RT-PCR，擴(kuò)增出了8個(gè)片段(A、B、C、D、E、F、G1和G2)，G1和G2通過(guò)融合PCR形成G片段。在A片段的上游引入了T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子，G片段通過(guò)融合PCR在其下游引入了T7 RN

8、A聚合酶的終止子和丁型肝炎病毒核酶序列。通過(guò)酶切連接的方法構(gòu)建出三個(gè)中間質(zhì)粒：pBR-ABC，pBR-DE和pBR-FG。再通過(guò)酶切連接的方法將ABC和DE插入pBR-FG中形成pBR-TS09-C全長(zhǎng)質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序分析，與TS09-C株全基因組序列相比，全長(zhǎng)質(zhì)粒上有6處突變，其中4處同義突變，僅兩處突變引起了氨基酸的改變，分析表明：這兩處氨基酸突變?cè)贜DV其他毒株中也同樣存在，不會(huì)影響到后續(xù)病毒的拯救恢復(fù)。
　　 四、新城疫病毒

9、熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　 為給后續(xù)的新城疫研究提供快捷的定量檢測(cè)方法，本研究建立了新城疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。經(jīng)對(duì)部分發(fā)表在NCBI里的新城疫病毒序列進(jìn)行比對(duì)，在其F基因上找到一個(gè)相對(duì)保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條TaqMan探針。以新城疫I系疫苗株(Mukteswar株)作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)系列條件優(yōu)化、特異性、靈敏性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，建立了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的熒光RT-PCR檢測(cè)

10、新城疫病毒的方法。該方法能檢測(cè)最低初始病毒濃度為102.2ELD50/mL，且在1082-1022ELD50/mL范圍內(nèi)Ct值與病毒的濃度的對(duì)數(shù)值(1gELD50/mL)呈很好的線(xiàn)性關(guān)系，R2達(dá)到0.9975；該方法與禽流感病毒、禽痘病毒和禽大腸桿菌等禽病病原核酸無(wú)交叉反應(yīng)；批間和批內(nèi)重復(fù)性良好；臨床樣品檢測(cè)中熒光RT-PCR與雞胚分毒的符合率、診斷靈敏度和診斷特異性分別為98.5%、50%和98.4%。因此，熒光RT-PCR檢測(cè)方法的