犬高危穿透性角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)與TNF-α變化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:本試驗(yàn)以重慶本地小型雜交犬為試驗(yàn)動物,先構(gòu)建高危(化學(xué)傷)角膜病理模型,而后進(jìn)行穿透性角膜移植手術(shù),術(shù)后觀察排斥反應(yīng)與外周血和角膜組織中TNF-α變化情況。
　　 方法:(1)選擇健康(無眼疾)本地犬34只作為試驗(yàn)犬,使用1mol/L的NaOH溶液對所有試驗(yàn)犬左眼角膜正中進(jìn)行堿燒傷。術(shù)后每天使用裂隙燈顯微鏡對術(shù)眼觀察各層情況并測量新生血管長度。(2)選擇17只健康本地犬作為供體犬,對34只堿燒傷模型犬行穿透性角膜移植手術(shù),

2、并嚴(yán)格監(jiān)控術(shù)中、術(shù)后的并發(fā)癥,術(shù)后分生理鹽水組和(1%RAPA)治療組分別處置。每天裂隙燈顯微鏡觀察術(shù)眼情況并記錄。(3)分別取生理鹽水組和(1%RAPA)治療組8只于建立燒傷模型前,手術(shù)當(dāng)日,術(shù)后第7、14、21、28、35、42、49、56d采前肢頭靜脈血,用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法檢測TNF-α濃度;其余18只犬隨機(jī)分成兩組(處置方法同上),分別在術(shù)后第7、28、56d各組隨機(jī)抽取3只取眼,另外選取3只健康犬作為空自

3、對照組,對所取角膜均分三份,一份用于測定犬角膜組織TNF-α含量,一份用于HE染色觀察角膜組織病理學(xué)變化;最后一份進(jìn)行熒光定量PCR檢測,最后使用△△Ct法分析角膜組織TNF-α基因的相對表達(dá)量。
　　 試驗(yàn)結(jié)果:(1)燒傷當(dāng)日角膜全層即刻呈現(xiàn)出銀白色云霧狀,3d后出現(xiàn)不同程度的水腫,混濁度明顯加劇,5d后角膜緣開始浸潤新生血管并向角膜中心方向生長,7d后炎癥加劇,血管向角膜中心彌散,9d左右某些角膜基質(zhì)層溶解現(xiàn)象加劇,新生血管

4、變得粗大,模型建立成功。(2)所有PKP術(shù)犬均無縫線崩裂現(xiàn)象,但有兩例在術(shù)后3天即發(fā)生急性排斥反應(yīng)需重新補(bǔ)充;生理鹽水組術(shù)后術(shù)犬術(shù)眼周圍均有大量分泌物分泌,3d時(shí)植片均出現(xiàn)輕微水腫,6d時(shí)角膜植片植床交界處開始出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng),7d時(shí)有部分血管開始長入角膜植片內(nèi),15d時(shí)所有術(shù)犬均出現(xiàn)捧斥反應(yīng),28d時(shí)植片開始出現(xiàn)質(zhì)感變硬的現(xiàn)象,56d時(shí)角膜組織開始肉質(zhì)化:(1%RAPA)治療組眼分泌物較之生理鹽水組少,3d時(shí)植片透明無明顯水腫現(xiàn)象,6

5、d時(shí)術(shù)犬出現(xiàn)新生血管向植片生長的現(xiàn)象。部分犬只角膜出現(xiàn)輕度水腫。7d時(shí)新生血管有所增多但仍未到達(dá)排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。15d時(shí)植片的水腫和混濁程度有明顯的改善,新生血管出現(xiàn)消退,28d時(shí)植片轉(zhuǎn)歸透明,56d時(shí)除3例排斥外其余角膜植片仍保持透明,未出現(xiàn)排斥反應(yīng)。(3)堿燒傷后及堿燒傷角膜移植術(shù)后早明各組實(shí)驗(yàn)犬外周血中TNF-α含量均升高,生理鹽水組含量于28d后達(dá)最高水平(94.10±1.66pg·ml-1)并在以后的監(jiān)測期內(nèi)維持較高含量,治療組

6、在臨床診斷捧斥反應(yīng)發(fā)生前術(shù)后第14d達(dá)最高水平(68.22±0.90pg·ml-1),而后開始下降,到術(shù)后56d幾乎接近術(shù)前正常水平(37.76±1.07pg·ml-1),生理鹽水組和治療組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);堿燒傷角膜移植術(shù)后各組(空白對照組除外)實(shí)驗(yàn)犬角膜組織中TNF-α含量均升高,在術(shù)后28d時(shí)治療組出現(xiàn)峰值(31.99±0.84pg·ml-1)而后下降,生理鹽水組含量在術(shù)后28d后仍在增長,并在術(shù)后

7、56d時(shí)達(dá)到37.53±0.94pg·ml-1且仍有繼續(xù)增長的趨勢;病理組織學(xué)結(jié)果顯示,術(shù)后7d:生理鹽水組角膜組織各層細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重水腫,上皮細(xì)胞層有溶解、丟失現(xiàn)象,基質(zhì)層增厚,內(nèi)有一定量新生血管生長及紅細(xì)胞侵潤。內(nèi)皮細(xì)胞部分?jǐn)嗔?、丟失。治療組角膜各細(xì)胞層有輕微水腫現(xiàn)象,上皮層有所增厚,有少量紅細(xì)胞侵潤.后彈力層和內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后28d,生理鹽水組角膜組織各層細(xì)胞水腫加劇,上皮細(xì)胞層開始出現(xiàn)斷裂脫離現(xiàn)象,基質(zhì)層內(nèi)有大量新生血管生長及

8、紅細(xì)胞侵潤,膠原纖維原有捧列被完全打亂,后彈力層與內(nèi)皮細(xì)胞層開始大量脫離和丟失。治療組術(shù)犬角膜各細(xì)胞層規(guī)則捧列,水腫現(xiàn)象明顯消退,上皮層完整無丟失,基質(zhì)層纖維排列較為緊湊均勻,新生血管生長和紅細(xì)胞侵潤現(xiàn)象有所改善,后彈力層和內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)仍保持完整。術(shù)后56d:生理鹽水組上皮細(xì)胞層幾乎完全溶解,僅存的細(xì)胞也己壞死,紅細(xì)胞以完全侵潤整個(gè)基質(zhì)層,幾乎沒有內(nèi)皮細(xì)胞存留。治療組各細(xì)胞層組織學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致,無明顯水腫增厚現(xiàn)象?；|(zhì)層纖維均勻排列,內(nèi)皮

9、層細(xì)胞僅少量缺失。(4)術(shù)后角膜中TNF-α基因的含量均有表達(dá)且無論是組內(nèi)或組間在不同時(shí)間段角膜TNF-α基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出一定的差異性,角膜TNF-α基因在不同時(shí)間段表達(dá)量與組織中含量的變化一致。
　　 結(jié)論:(1)雷帕霉素滴眼液滴眼液對犬高危穿透性角膜移植手術(shù)能起到抗免疫排斥反應(yīng)作用,能夠明顯抑制新生血管生長,發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制作用。(2)TNF-α濃度變化與裂隙燈顯微鏡觀察和病理組織切片結(jié)果一致,外周血1NF-α含量變化