玉米大斑病菌MAPK級(jí)聯(lián)途徑中StSTE12基因的克隆與功能分析.pdf

1、為了明確玉米大斑病菌Fus3/Kss1-homolog途徑在病菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的調(diào)控作用,本研究通過(guò)候選基因法和Genome-walking技術(shù)克隆得到了玉米大斑病菌MAPK級(jí)聯(lián)途徑Fus3/Kss1通路下游的一個(gè)基因StSTE12;利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)它與其它植物病原真菌的Ste12-like蛋白聚為同一類,具有這類轉(zhuǎn)錄因子特有的保守結(jié)構(gòu)域;利用β-半乳糖苷酶法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),StSte12具有轉(zhuǎn)

2、錄自激活活性;通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)初步證明StSte12受StStk2的調(diào)控;通過(guò)酵母異源互補(bǔ)和RNA干擾(RNAinterference,RaNAi)兩種方法分別創(chuàng)制酵母異源互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子和RNAi沉默轉(zhuǎn)化子,并通過(guò)對(duì)酵母功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子和RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析,明確了該基因主要參與了病菌的附著胞發(fā)育及侵染過(guò)程,本試驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用候選基因法及Genome-walking技術(shù)得到了玉米大斑病菌StSTK2基因下游

3、的轉(zhuǎn)錄因子StSTE12,該基因DNA全長(zhǎng)為2816bp,cDNA為2085bp,編碼694個(gè)氨基酸,包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子;通過(guò)蛋白比對(duì)發(fā)現(xiàn),StSte12具有轉(zhuǎn)錄因子特有的STEhomeodomain和ZnFCzH2鋅指結(jié)構(gòu);同源性分析顯示,該基因與其它植物病原真菌的STE12-like基因有較高的同源性。
　　 2.利用β-半乳糖苷酶法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),StSte12能夠激活下游基因LACZ的表達(dá),經(jīng)X-α-Gal染色后顯示藍(lán)

4、色,說(shuō)明StSte12具有轉(zhuǎn)錄自激活活性;通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn),StSte12受StStk2的調(diào)控,對(duì)于它們之間究竟如何作用還需進(jìn)一步的研究。
　　 3.將StSTE12基因轉(zhuǎn)化至釀酒酵母ScSTE12基因的缺失突變體中,篩選釀酒酵母ScSTE12基因的功能互補(bǔ)突變體并對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)StSTE12基因可以回復(fù)釀酒酵母ScSTE12基因的功能,能夠調(diào)控酵母細(xì)胞的侵入生長(zhǎng)。
　　 4.以pSilent-1質(zhì)粒作為載體,

5、構(gòu)建StSTE12基因的RNA干擾載體,將該載體通過(guò)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體,通過(guò)潮霉素B篩選、PCR檢測(cè)以及RT-PCR的驗(yàn)證得到了3株StSTE12基因的RNAi轉(zhuǎn)化子。
　　 5.對(duì)StSTE12基因的RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的致病力均降低,且不能夠直接侵染健康的玉米植株,只能通過(guò)傷口侵入,但是轉(zhuǎn)化子的毒素活性并不減弱。此外,與野生型菌株相比,轉(zhuǎn)化子的分生孢子產(chǎn)量、黑色素的生物合成明顯減少,附