親和層析介質(zhì)的制備及其對家蠅GABA受體的分離純化.pdf

1、γ-氨基丁酸(aminobutyricacid，GABA)受體是殺蟲劑的重要作用靶標。它的結(jié)構(gòu)與相關(guān)農(nóng)藥毒理和抗藥性密切相關(guān)。因此，分離純化GABA受體，并研究其立體結(jié)構(gòu)，對于開發(fā)高效、低毒、安全農(nóng)藥和克服害蟲的抗藥性具有重要的指導意義。本文以家蠅為研究對象，研究了GABA受體的親和分離方法。
　　 通過文獻調(diào)研，總結(jié)了GABA受體的分離純化方法，分析了去污劑對受體分離效率的影響規(guī)律，并利用計算化學的方法，從文獻報道的小分子中，

2、確定親和層析的配體為Ro7-1986/1。通過基質(zhì)活化、偶聯(lián)和封閉等過程制備了親和層析介質(zhì)，并確定了該親和層析柱的應用條件。
　　 基質(zhì)活化：選擇Sepharose6B作為親和層析基質(zhì)，1，4-丁二醇二縮水甘油醚為活化劑，直接連接在基質(zhì)上。所得活化的Sepharose6B上含有的環(huán)氧基密度為65.27μmol/g膠。研究了活化溫度、時間及pH等條件對活化效率的影響。最終確定了1，4丁二醇而縮水甘油醚活化Sepharose6B的最

3、佳實驗條件為：5.0gSepharose6B、5.0mL0.3mol/L的NaOH溶液和10mgNaBH4混合，再加入5mL1，4-丁二醇二縮水甘油醚和5.0mL，DMSO，35℃條件下170rpm振蕩8h。
　　 偶聯(lián)與封閉：活化的Sepharose6B上的環(huán)氧基與Ro7-1986/1末端的伯氨基反應，將Ro7-1986/1固定在Sepharose6B上，再用1mol/L乙醇胺溶液封閉殘余環(huán)氧基，最終Ro7-1986/1的偶聯(lián)

4、度為62.09μmol/g膠。
　　 親和層析柱分離：將制備好的親和層析介質(zhì)Ro7-1986/1-Sepharose6B裝柱，分離純化家蠅腦組織內(nèi)的GABA受體。通過親和層析和離子交換層析，目的蛋白質(zhì)濃度為7.3μg/mL，總量為182.5μg。凝膠電泳分析得到了分子量分別為45kD、50kD和80kD左右的三條條帶，可能為家蠅GABA受體的α、β和γ亞基，與文獻報道的其他生物的對應亞基相近。
　　 本文的創(chuàng)新點在于利用