家蠶對有機磷農(nóng)藥的代謝抗性機制研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是鱗翅目的模式昆蟲，人工馴化歷史已經(jīng)有5000多年。家蠶生產(chǎn)過程中，每年由于農(nóng)藥中毒造成大量減產(chǎn)，特別是近年來，有許多蠶區(qū)的秋蠶都放棄飼養(yǎng)，至今國內(nèi)沒有育成對農(nóng)藥存在明顯抗性的家蠶的品種。
　　 有機磷殺蟲劑（Organophosphate，OP）是害蟲防治中最常用的一種農(nóng)藥，桑田噴灑有機磷農(nóng)藥，不能徹底防治桑園害蟲，反而會使家蠶中毒，這已經(jīng)成為制約蠶業(yè)發(fā)展的一對矛盾。
　

2、　 為了研究家蠶對有機磷農(nóng)藥的代謝抗性機制，本文以大造和菁松×皓月為材料，研究了家蠶在添食辛硫磷農(nóng)藥以后3大解毒酶系(細(xì)胞色素P450氧化酶(P450s)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和酯酶(ESTs))的活性變化情況，此外利用基因芯片研究了全基因組水平抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄特征，同時利用HPLC方法研究了辛硫磷農(nóng)藥在家蠶體內(nèi)的代謝分布特征，獲得如下結(jié)果：
　　 1解毒酶活性的研究
　　 1.1家蠶添食辛硫磷后解毒酶活

3、性的測定
　　 本研究測定了5齡3d家蠶對辛硫磷的LC50和辛硫磷中毒后家蠶中腸和脂肪體中P450s、GSTs和ESTs的活性水平。結(jié)果顯示：5齡3d家蠶對辛硫磷的LC50為7.86μg/mL(24h)。經(jīng)農(nóng)藥誘導(dǎo)后，P450s在中腸和脂肪體中活力分別是對照的1.72倍和6.72倍；GSTs在中腸沒有變化，在脂肪體中是對照的1.11倍；ESTs在中腸和脂肪體中分別是對照的0.69倍和1.13倍，推測其可能存在“脂族酯酶突變假說”

4、現(xiàn)象。結(jié)果表明，添食辛硫磷以后，家蠶3大解毒酶活性都發(fā)生改變，說明解毒酶在代謝辛硫磷農(nóng)藥過程中起作用，但活性很低，推測家蠶的解毒酶活性較低是容易發(fā)生中毒的原因。本研究為進(jìn)一步研究家蠶對辛硫磷農(nóng)藥的抗性機制提供基礎(chǔ)。
　　 2.2家蠶代謝辛硫磷過程中解毒酶活性變化特征分析
　　 本實驗研究了家蠶添食辛硫磷農(nóng)藥(5μg/頭)24h內(nèi)3種解毒酶的活性變化特征。結(jié)果顯示，添食辛硫磷后，P450s在脂肪體中的活性高于中腸，在脂肪體

5、中2h以后上升，24h時是對照的2.85倍；在中腸中12h達(dá)到最高值，是對照的1.89倍。GSTs在脂肪體中的活性高于中腸，在脂肪體中12h時達(dá)到最高值，是對照的1.69倍；在中腸中24h時達(dá)到最高值，是對照的1.21倍。ESTs活性在中腸中高于脂肪體，在添食0.5h之后下降，10h時降到最低，在中腸和脂肪體中分別是對照的0.15倍和0.40倍；10h后上升，24h時分別是對照的1.14倍和0.75倍。結(jié)果表明家蠶代謝辛硫磷過程中解毒酶

6、的特征為：P450代謝解毒的主要器官是脂肪體，添毒2h后代謝作用增加；GSTs的解毒作用較為平緩；在家蠶中可能也存在酯酶的“突變學(xué)說”的現(xiàn)象，代謝轉(zhuǎn)折時間是10h。本研究為解明三大解毒酶系在家蠶代謝有機磷農(nóng)藥過程中的生理作用及家蠶代謝解毒的分子機制打下基礎(chǔ)。
　　 2抗性相關(guān)基因的表達(dá)研究
　　 2.1利用芯片分析辛硫磷誘導(dǎo)后家蠶全基因組水平基因轉(zhuǎn)錄特征
　　 我們利用全基因組芯片研究了家蠶個體水平經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)2

7、4h以后的基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，有247個基因表達(dá)差異顯著，其中68個基因上調(diào)表達(dá)，179個基因下調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)26倍，最低下調(diào)29倍。對差異表達(dá)的基因分析發(fā)現(xiàn)它們的功能分為10類。上調(diào)表達(dá)的基因主要參與糖代謝、脂肪代謝、氨基酸水解和電子傳遞過程等，下調(diào)表達(dá)的基因主要參與細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間信號級聯(lián)傳遞等。我們首次從全基因組水平研究家蠶經(jīng)辛硫磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后的基因表達(dá)水平，為我們進(jìn)一步研究家蠶及其他鱗翅目昆蟲代謝有

8、機磷殺蟲劑提供了新思路。
　　 2.2家蠶腸粘蛋白基因BmⅡM1的克隆及辛硫磷的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄分析
　　 本研究以5齡3d幼蟲中腸為材料，通過RT-PCR克隆獲得家蠶腸粘蛋白cDNA序列，命名為BmⅡM1（GenBank登錄號：JN256080）。序列分析表明，BmⅡM1開放閱讀框長度為870bp，編碼289個aa，相對分子質(zhì)量約為31.78 kDa，等電點為4.56。通過定量PCR分析了mRNA的組織轉(zhuǎn)錄特征以及辛硫磷農(nóng)藥誘

9、導(dǎo)以后的轉(zhuǎn)錄特征。結(jié)果顯示：BmⅡM1只在中腸中表達(dá)，辛硫磷誘導(dǎo)以后，在中腸中的轉(zhuǎn)錄水平是對照的12.3倍，推測該基因在家蠶保護(hù)中腸組織免受辛硫磷農(nóng)藥毒害中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步研究家蠶nM基因的功能打下基礎(chǔ)，也為昆蟲nM和殺蟲劑的作用關(guān)系提供參考。
　　 2.3辛硫磷誘導(dǎo)后家蠶乙酰膽堿酯酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征分析
　　 本文研究了辛硫磷誘導(dǎo)24、48、72及96h后家蠶乙酰膽堿酯酶基因(Acetylcholines

10、terase Gene，ace)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征。結(jié)果顯示，Bm-AChE-1和Bm-AChE-2在家蠶腦、脂肪體和絲腺中的轉(zhuǎn)錄均表現(xiàn)為先上升后下降的變化規(guī)律，其中在腦組織中24h兩者的上升幅度最大，分別達(dá)16.22和68.71倍；在脂肪體和絲腺中的變化幅度較??；在中腸中兩基因均表現(xiàn)出先下降后上升的特點。結(jié)果表明，在家蠶對辛硫磷的解毒過程中，不同組織內(nèi)Bm-AChE-1和Bm-AChE-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異，Bm-AChE-1在脂肪體代謝

11、農(nóng)藥過程中發(fā)揮重要作用，Bm-AChE-2在腦中起重要作用。本研究為深入研究昆蟲兩種乙酰膽堿酯酶基因的功能提供參考。
　　 2.4家蠶經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后中腸和脂肪體中基因的轉(zhuǎn)錄特征
　　 為了研究家蠶中腸和脂肪體中的基因在代謝辛硫磷農(nóng)藥中的作用，本研究利用全基因組芯片研究了5齡3d幼蟲經(jīng)辛硫磷農(nóng)藥(4μg/mL)誘導(dǎo)24h后中腸和脂肪體中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征。結(jié)果顯示，經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后中腸中有299個基因顯著差異表達(dá)，其中上調(diào)2

12、09個，下調(diào)90個；脂肪體中顯著差異表達(dá)的基因有1040個，其中上調(diào)表達(dá)569個，下調(diào)表達(dá)471個。GO功能分析顯示，中腸中差異表達(dá)的基因功能主要分為8類，有168個基因功能已知；脂肪體中差異表達(dá)的基因功能主要分為11類，有639個功能已知。對上調(diào)表達(dá)基因CYP4G25(sw20730)和CYP9a21(sw20566)進(jìn)行了定量PCR驗證，結(jié)果和芯片雜交結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，經(jīng)辛硫磷農(nóng)藥誘導(dǎo)以后，家蠶體內(nèi)脂聯(lián)素受體基因(sw0910

13、6)、CYP4G25(sw20730)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(sw04971)等高水平表達(dá)，并出現(xiàn)辛硫磷引起細(xì)胞損傷的癥狀，由此引起多種生物學(xué)過程發(fā)生變化。通過對中腸進(jìn)行病理切片，證明經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后中腸出現(xiàn)圓筒形細(xì)胞死亡，杯狀細(xì)胞裂解，腸膜破碎等癥狀。本研究為闡明昆蟲對辛硫磷的抗性及辛硫磷對昆蟲的毒害和損傷機理打下基礎(chǔ)。
　　 3.利用HPLC分析辛硫磷在家蠶體內(nèi)的代謝分布特征
　　 為了研究辛硫磷在鱗翅目昆蟲體內(nèi)不同組織

14、中的代謝特征，本文以家蠶（菁松×皓月）為研究對象，用高效液相色譜法測定了不同時間中腸、血液、脂肪體和絲腺中辛硫磷的含量。結(jié)果表明，中腸中辛硫磷含量在添食0.5h時達(dá)到最高值4.35μg/g，0.5h降低；血液中辛硫磷含量在th時達(dá)到最高值1.72μg/mL;脂肪體中辛硫磷含量在注射后上升,4h時達(dá)到最高值3.65μg/g,4h之后下降；絲腺中辛硫磷含量比較穩(wěn)定，24h達(dá)到最高值1.45μg/g。辛硫磷農(nóng)藥的其代謝特征是：辛硫磷通過家蠶中

15、腸后，經(jīng)過血液的運輸，在脂肪體內(nèi)積累代謝，在絲腺中具有積累儲存的作用。通過研究辛硫磷在家蠶體內(nèi)的代謝分布特征，對于深入研究各組織在代謝解毒中的功能具有重要的參考價值。
　　 通過本課題的開展，從酶活水平、基因水平及藥物代謝分布水平研究了家蠶對辛硫磷農(nóng)藥的代謝抗性機制，同時初步探討了辛硫磷農(nóng)藥對家蠶的損傷機制。通過本課題的研究，為家蠶抗性品種的轉(zhuǎn)基因選育提供理論依據(jù)，此外，研究鱗翅目的模式昆蟲家蠶對有機磷農(nóng)藥的代謝抗性，對于開發(fā)針