水稻miR319的耐冷功能分析與分子機制研究.pdf

1、低溫是影響水稻生產的重要環(huán)境限制因素之一，其中苗期冷害會使植株枯黃、分蘗減少，嚴重時可引起植株生長發(fā)育遲緩，進而導致減產或絕收。了解水稻苗期冷害發(fā)生的分子機制，改良水稻的耐冷性和培育耐冷水稻新品種是解決低溫對水稻生產影響的關鍵。植物耐受低溫脅迫是一個系統的調控過程，需要眾多基因參與。microRNA是長度為21nt左右的單鏈RNA分子，被證明參與許多生物學過程的調控。miR319被證明參與植物生長發(fā)育的調控，我們在前期的研究中，通過基因

2、芯片分析發(fā)現，水稻miR319a/b在冷脅迫下差異表達，推測miR319a/b在水稻耐受低溫脅迫時發(fā)揮作用。本研究對水稻幼苗進行低溫脅迫處理，采用半定量RT-PCR方法，分析miR319表達特性，驗證前期基因芯片分析結果。構建pre-miR319a/b植物表達載體，對水稻進行遺傳轉化，獲得了pre-miR319a及miR319b超量表達水稻植株。對野生型水稻和過量表達植株進行脅迫處理研究miR319耐冷功能。利用psRNA Target

3、軟件預測miR319靶基因，并利用miR319b過量表達植株進行real-time PCR驗證其靶基因。采用real-time RT-PCR方法，分析冷脅迫Marker基因表達，初步闡明miR319b調控植物耐冷的分子機制。主要研究結果如下：
　　 ⑴水稻冷脅迫相關miRNA的驗證。通過冷脅迫處理下的RT-PCR結果分析，miR319a/b在冷脅迫0.5h時下調表達，隨著處理時間的增加表達量有所升高，在3h時以后，miR319a

4、/b的表達量繼而下降。RT-PCR驗證了本實驗室前期的芯片研究結果，顯示了miR319a與miR319b是對冷脅迫具有響應。
　　 ⑵miR319在水稻中的過量表達及耐冷功能分析。構建了融合有pre-miR319a/b的植物表達載體，采用農桿菌介導的遺傳轉化的方法對水稻愈傷組織進行遺傳轉化。通過PCR、southern blot、RT-PCR對抗性植株進行了分子生物學檢測，每個基因得到轉基因植株3株以上，并利用stem-loop

5、 qRT-PCR檢測miR319a/b成熟體在轉基因植株中表達量，結果表明，轉pre-miR319a基因植株miR319a表達量基本無變化；轉pre-miR319b基因植株中miR319b的表達量明顯提高。通過分析T2轉基因及野生型植株在冷脅迫處理下的表型，結果表明：pre-miR319a轉基因植株與野生型植株種子大小及在萌發(fā)1d-15d各階段均無差異：在冷處理后，轉基因水稻與野生型水稻的生長狀況無明顯區(qū)別。miR319b過量表達水稻的

6、種子比野生型小，且萌發(fā)后15d幼苗miR319b過量表達植株明顯比野生型植株低矮，第一片真葉至第二片真葉之間的節(jié)間變短，但是植株的生長并沒有受到抑制；三葉期時，miR319b基因提高了水稻的耐冷性，成活率明顯升高，脯氨酸含量升高。
　　 ⑶水稻miR319靶基因的預測及生物學驗證。通過miRNA靶基因預測軟件工具psRNA Target，我們預測得到了26個miR319的靶基因；通過對過表達植株的定量分析驗證了其中兩個靶基因：O

7、s＿03g57190(PCF6)和Os＿07g05720(OsTCP21)，這兩個基因均屬于TCPs轉錄因子家族。在已有的研究報道中，TCPs轉錄因子可以促進植物細胞的增殖，抑制細胞的分化。
　　 ⑷miR319b介導的冷脅迫應答分子機制。通過對miR319b過表達植株與野生型植株冷脅迫相關Maker基因定量分析，我們發(fā)現在冷脅迫下一些關鍵的Maker基因如DREB/CBF類基因、TPPs等在過表達植株中上調表達，而OsCPT1

8、基因下調表達。TPPs基因受冷脅迫誘導表達，可以直接的提高水稻的冷脅迫能力。DREB/CBF轉錄因子類基因在過量表達植株中轉錄水平提高，可以促使該類轉錄因子的表達，誘導下游冷脅迫應答基因的表達，提高水稻的耐冷性。miR319通過間接調控這些基因的表達，提高植物的冷脅迫耐性。OsCPT1基因一個是的DREB1A轉錄因子的靶基因。在OsMYB3R-2過量表達植株中，該基因在冷脅迫下誘導表達，脯氨酸含量升高，提高轉OsMYB3R-2基因植株的