轉(zhuǎn)細胞凋亡抑制基因p35和iap玉米抗紋枯病的研究.pdf

1、玉米紋枯病是一種分布范圍較廣的世界性真菌病害，其病原菌主要是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani kühn），它具有強腐生性和寬寄主范圍，目前尚未挖掘出高抗或免疫紋枯病的玉米新品種，玉米紋枯病的防治還主要依賴于化學(xué)防治和農(nóng)業(yè)防治。為了得到具備廣譜和持久抗性的玉米新種質(zhì)，抵抗死體營養(yǎng)型病原菌誘發(fā)的病害，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法將分別來源于苜蓿斜紋夜蛾昆蟲桿狀病毒和甜菜夜蛾中的凋亡抑制基因p35、iap同時導(dǎo)入玉米

2、中。
　　 本實驗分別構(gòu)建了融合基因表達載體和雙價表達載體。在構(gòu)建融合基因表達載體中，依據(jù)目的基因p35和iap的編碼區(qū)序列設(shè)計了6條引物;為了使兩基因能夠高效表達，除了使用連接多肽LP4/2A構(gòu)建融合基因之外，設(shè)計引物時，我們對位于融合基因之前的p35基因的起始密碼子的周邊序列進行了優(yōu)化，引入了Kozak序列，并在位于融合基因之后的iap基因和啟動子之前引入了Ω序列，它是來源于煙草花葉病毒(TMV)富含TTAAC序列的非翻譯前

3、導(dǎo)序列，常作為增強子使用;從植物表達載體pCAMBIA1305.1-p35和pBI121-iap中分別擴增出p35和iap兩個基因，p35基因的大小為900bp，iap基因的大小為1137bp;利用重疊PCR技術(shù)(overlappingPCR)將p35和iap兩基因用連接多肽LP4/2A連接起來形成融合基因p35-LP4/2A-iap，置于玉米泛素啟動子UBI-1之后，連接到植物表達載體pCABIA3301中，構(gòu)建成融合基因表達載體pC

4、A3301-p35-LP4/2A-iap。在構(gòu)建雙價表達載體時，將p35和iap基因各置于一套表達框內(nèi)，p35基因由玉米泛素啟動子UBI-1啟動，置于植物表達載體pCAMBIA3301的多克隆位點中;iap基因由CaMV35S啟動子啟動，取代pCAMBIA3301上的gus基因，形成雙價表達載體pCA3301-p35-iap。經(jīng)PCR檢測、酶切驗證和全長測序驗證，兩表達載體上的各目的片段序列完整正確，連接無誤。
　　 通過農(nóng)桿菌

5、介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的表達載體上的目的基因?qū)胗衩鬃越幌礎(chǔ)188和綜31中，共得到52株成活的轉(zhuǎn)基因玉米，經(jīng)巢氏PCR檢測，共有19株轉(zhuǎn)基因植株呈PCR陽性，初步確定外源基因已經(jīng)整合到這19株轉(zhuǎn)基因玉米的基因組中。
　　 對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片接種立枯絲核菌（Rhizoctonia solanikühn），觀察發(fā)病情況。接種3天后，觀察到對照植株的葉片發(fā)病比較嚴重，出現(xiàn)大塊的病斑;而轉(zhuǎn)基因植株中有6株的