豬偽狂犬病鑒別診斷研究與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列的測定.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由α皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus,PrV)引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種烈性傳染病.豬 該病毒的天然宿主和貯存者.該病給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失.預防、控制和最終根除該病是中國當前面臨的一項艱巨任務.在歐美等發(fā)達國家,偽狂犬病的根除計劃多采用gE或gG基因標記疫苗和相應的gE或gG鑒別診斷方法來進行.gG糖蛋白是PrV的一種分泌蛋白,gE糖蛋白在決

2、定病毒的毒力及神經(jīng)嗜性等方面起著重要作用,但兩者都不是PrV增殖所必需的蛋白,因此可作為缺失的候選基因.目前中國已研制成功gE和gG基因標記疫苗.為了建立適合中國國情的gE和gG鑒別診斷方法,開展了以下研究.1.PrVgG基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達.依據(jù)偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus PRV)Rice株序列,合成針對gG基因的特異性引物,從PRV鄂A株中擴增出gG基因,并將其克隆到pBluescriptⅡSK+

3、質粒中并測序,用SacI和HindⅢ酶切,將gG基因融合到pET-28a質粒中T<,7>啟動子下游,構建成原核表達質粒pET-28A-gG<,1>,結果并未獲得表達.2.gG-LAT和gG-ELISA的建立.以PRV gV基因表達提純產物為抗原分別致敏乳膠和包被酶標板,摸索最佳的致敏和包被條件,建立了gG-LAT和gG-ELISA.3.PrVgE基因的主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中的表達.將偽狂犬病毒(PRV)Ea株gE基因主要抗原表位區(qū)段

4、融合到原核表達載體pET28b的T7啟動子下游,構建成原核表達質粒,經(jīng)IPTG誘導,SDS-PAGE和Westernblot印跡分析,證實gE基因主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中獲得了表達,表達產物具有抗原性,分子量為38kD,位于包涵體中.4.gE-LAT和gE-ELISA的建立.gE基因主要抗原表位區(qū)表達的包涵體蛋白經(jīng)變體、復性處理后,復性產物致敏乳膠,并對抗原致敏濃度、致敏時間、致敏溫度進行優(yōu)化,建立了gE乳膠凝集試驗(gE-LAT).