大豆β-伴大豆球蛋白α亞基基因轉化大豆初步研究.pdf

1、RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引起的特異性序列的轉錄后基因沉默。大豆種子的儲藏蛋白基因的表達調控主要發(fā)生在轉錄水平和轉錄后水平上。提高11S球蛋白的含量或降低7S球蛋白的含量可改善大豆蛋白的功能特征和營養(yǎng)品質，卻不會改變總蛋白質和脂肪的含量。因此，本實驗以β-伴大豆球蛋白α亞基基因為靶基因設計RNA干擾載體，并將其轉化大豆，探究此基因對提高種子中含硫氨基酸的貢獻，推測大豆11S與7S

2、的調控機制。本實驗對該基因進行了以下幾個方面的研究:
　　首先，根據大豆β-伴大豆球蛋白α亞基基因序列(GenBank No.AB 051865)同大豆基因組數據庫的比對結果，初步認定，該基因在大豆基因組中具有兩個拷貝，這兩個拷貝都位于第20號染色體上，分別對應Glyma20g28650和Glyma20g28660。這兩個拷貝在編碼區(qū)上都包含6個外顯子與5個內含子，ORF完全相同，且都編碼605個氨基酸。用7Sα基因編碼的氨基酸序

3、列與同源基因繪制的進化樹表明，與苜蓿(Mt)的親源關系最近，與毛果楊(Pt)的親源關系最遠。在7Sα基因表達形成的蛋白質的N端檢測到跨膜結構和信號肽。
　　根據Gm7Sα基因的特點，借助Gateway方法，構建了該基因的干擾載體(簡寫為pBI-Gm7SαRi)。在對農桿菌介導的大豆子葉節(jié)的遺傳轉化體系中滅菌時間，標記基因的篩選壓進行優(yōu)化后，用構建好的干擾載體對組培性狀良好的大豆品種進行了轉化。最終獲得了71株轉化苗，T0代收獲種子

4、161粒，播種于大田后，由于鳥害等的影響，成活65株。除對轉化苗的表型進行觀察外，還做了進一步的實驗研究，即對T1代進行除草劑涂抹實驗，葉片的PCR檢測以及熒光定量確定拷貝數等多種方法對轉化苗進行檢測后，確定了20株陽性轉基因植株，其中南農88-1有13株，Jack有7株。
　　高代RNAi-Gm7Sα轉基因植株采用系譜法對后代進行選擇。選擇優(yōu)良單株，收獲種子后點播成行。分別對轉基因后代進行分子檢測和氨基酸含量測定，發(fā)現Gm7Sα