甘藍型油菜自交不親和恢復機理研究及應用.pdf

1、自交不親和性是植物進化出的一種防止自交衰退、促進異交以更好地適應環(huán)境的遺傳機制，在研究和應用兩方面均具有重要意義。自交不親和是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。栽培的甘藍型油菜(AACC)表現(xiàn)為自交親和，但是人工合成的甘藍型油菜及其兩個基本種白菜(AA)和甘藍(CC)卻是自交不親和的。本研究以人工創(chuàng)建的甘藍型油菜自交不親和系‘S-1300'，自然存在的親和甘藍型油菜‘10-9-8400'和‘Westar'等為材料，通過遺傳分析、基因克隆、表達

2、分析、啟動子序列分析、遺傳轉化、轉錄組測序等研究手段對甘藍型油菜自交親和/不親和的分子機制進行了研究，初步揭了示油菜自交親和的原因，為研究油菜花粉-柱頭互作的分子機理打下了基礎。同時本研究還創(chuàng)建了鑒別S單倍型的分子標記體系，用于選育自交不親和雜種，將提供育種效率、加快育種進程。主要結果如下:
　　1.‘S-1300'自交不親和性的遺傳分析
　　鑒定‘S-1300'和‘10-9-8400'的S單倍型組成發(fā)現(xiàn)，他們在C基因組上含

3、有共同的S單倍型BnS-6，而A基因組不同，分別為BnS-1300和BnS-1。分析‘S-1300×10-9-8400'分離群體植株S位點基因型和表現(xiàn)型，證明‘S-1300'A基因組上的S單倍型BnS-1300決定其自交不親和性，來源于BrS-60。
　　2.同源序列法克隆‘S-1300'A基因組S位點基因
　　根據(jù)白菜BrS-60的序列設計引物，克隆S單倍型BnS-1300上的自交不親和基因。發(fā)現(xiàn)BnSP11-1300全長

4、為378bp，包括兩個外顯子和一個內(nèi)含子，序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與BrSP11-60具有100％的序列相似性。BnSRK-1300長度為7967bp，包含7個外顯子與6個內(nèi)含子，與BrSRK-60的CDS序列具有100％的相似性，但是在內(nèi)含子1，內(nèi)含子3與內(nèi)含子5卻分別有數(shù)個堿基的差異。BnSP11-1300與BnSRK-1300均只在花蕾中、而不在根、莖、葉和角果中表達，符合蕓薹屬自交不親和基因的表達特點。
　　3.自交不親和分子標

5、記體系的建立
　　克隆了恢復系‘10-9-8400'A基因組BnSRK-1的全長CDS序列和BnSP11-1全長序列。分析本研究得到的‘S-1300'和‘10-9-8400'以及本實驗室已有的保持系‘Bing409'S位點基因序列，開發(fā)分子標記。標記SRK1-1和SCR1-1只在恢復系‘10-9-8400'中擴增，標記SRK-1300只在自交不親和系‘S-1300'中擴增，標記SCR7-2只在保持系‘Bing409'中擴增。優(yōu)化P

6、CR反應體系得到了兩個多重PCR分子標記SRK-1300/SRK1-1及SRK-1300/SCR7-2。這些標記在91份甘藍型油菜自交親和品系極其與‘S-1300'的雜種中得到了驗證。
　　4.BnSP11-1啟動子區(qū)Helitron轉座子的發(fā)現(xiàn)及進化分析
　　發(fā)現(xiàn)油菜品系‘Westar'A基因組上BnSP11-1基因啟動子區(qū)的一個3.6kb長的片段為一個非自主的Helitron轉座子，該轉座子只出現(xiàn)在帶有BnS-1的油菜中

7、。通過比對其在轉座過程中帶入的基因組片段，我們在BrS-47的SP11基因下游發(fā)現(xiàn)了另一個Helitron轉座子，但是在油菜的BnS-1上卻沒有這個轉座子。由于BnS-1來源于BrS-47，同時兩個轉座子有相同的邊界序列，相同的3'末端的莖環(huán)結構。我們推測在甘藍型油菜的形成過程中，Helitron轉座子的移動改變了油菜的授粉方式（由異花授粉變?yōu)槌．惢ㄊ诜郏?，從而使該物種能保存下來并對油菜的進化產(chǎn)生重大影響。
　　5.BnSP11-

8、1基因啟動子順式元件的鑒定
　　去掉Helitron轉座子的BnSP11-1基因啟動子能驅動GUS報告基因特異地在成熟花藥中表達。進一步通過兩輪的啟動子缺失分析，發(fā)現(xiàn)BnSP11-1基因啟動子有多個順式元件協(xié)同作用控制著SP11基因的時空特異性表達，其中最主要的一個順式元件被發(fā)現(xiàn)位于-227bp到-217bp(5'-TTCTAGGGAT-3')的區(qū)域。
　　6.基因BnSP11-1的功能互補分析
　　通過轉基因手段將功

9、能完整的BrSP11-47基因導入到油菜品系‘Westar'中，得到了自交不親和的甘藍型油菜。授粉實驗表明，野生型‘Westar'的柱頭能接受自身的花粉，但拒絕轉基因材料的花粉。這些結果再次證明了SP11基因失活導致甘藍型油菜自交親和。
　　7.柱頭親和/不親和反應的RNA-seq分析
　　利用野生型‘Westar'柱頭針對自身花粉與轉基因花粉的不同授粉特性，提取授以不同花粉柱頭的RNA，對柱頭親和和不親和反應進行RNA-s