豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF4表達缺失株的構建及其功能研究.pdf

1、目的:豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。同時，PCV2可能存在人畜共患病原的潛在威脅，但PCV2的致病機制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病機理研究中，已有3個開放閱讀框(ORFs)的功能得到驗證:ORF1表達Rep和Rep'兩個復制相關蛋白，參與病毒復制;ORF2表達病毒蛋白外殼;ORF3編碼蛋白參與病毒介導的細胞凋亡。ORF4重疊于ORF3內，其對于病毒致病機制

2、的功能尚不清楚。本研究通過構建PCV2 ORF4表達缺失突變病毒，研究該蛋白于病毒復制和介導細胞凋亡的作用。同時，在本課題組前期工作確定ORF3/ORF4發(fā)生轉錄并獲得相關3' poly(A)加尾位點的基礎上，對ORF3/ORF4轉錄產物的5'端起始位點進行確認，為ORF4基因功能研究奠定基礎，為研究PCV2致病機理提供新的研究方法和理論依據(jù)。
　　方法:首先，在課題組已獲得PCV2基因組全長序列的基礎上，對序列進行分析，選擇病毒

3、突變位點。通過起始密碼子突變和引入無義突變使突變后的閱讀框轉錄產物在蛋白翻譯過程中提前終止，從而無法產生有效蛋白。依據(jù)PCR定點突變試劑盒原理構建突變體質粒，經酶切回收病毒基因組片段，在自環(huán)化反應后轉染PK-15宿主細胞以產生突變病毒。產生的病毒通過檢測體外復制能力、RNA剪接和外殼蛋白的形成，最終確定重組及突變病毒的完整性和感染力。構建了熒光定量檢測體系，并利用該體系檢測等拷貝數(shù)野生型、重組野生型和突變型病毒感染細胞后病毒DNA拷貝數(shù)

4、和ORF1、ORF3、ORF4 mRNA表達量差異，分析ORF4蛋白缺失對病毒復制的影響。在病毒感染細胞凋亡分析中，通過caspase家族活性檢測，檢測重組野生型和突變型病毒在病毒介導細胞凋亡功能上的差異。最后，利用5' RACE技術對ORF4基因mRNA5'末端轉錄起始位點進行鑒定。
　　結果:(1)成功構建了具有體外感染能力的重組野生型和突變型病毒，并且突變病毒的突變位點在連續(xù)傳代第十五代病毒中仍然存在。(2)成功構建了可用于

5、病毒滴度及多個ORF mRNA表達量測定的熒光定量檢測體系，定量范圍為2.53×102～2.53×107拷貝數(shù)之間(R2＞0.99)。(3)通過檢測等滴度野生型、重組野生型和突變型病毒感染細胞后病毒拷貝數(shù)和mRNA表達量上的變化，發(fā)現(xiàn)ORF4與病毒復制能力無關。同時各mRNA表達量檢測中發(fā)現(xiàn)，ORF4蛋白缺失不影響ORF4 mRNA表達。ORF4蛋白的缺失提高了ORF3的mRNA表達水平而參與病毒介導的細胞凋亡。同時，該蛋白缺失使病毒在